月季花总黄酮对小鼠反复脑缺血再灌注模型脑组织NO、NOS水平及含水量的影响

周红敏，周淑娟

(郑州市第六人民医院，河南 郑州 450015)

月季花为蔷薇科植物月季(RosachinensisJacq.)的花蕾和初开放的花，遍布我国大部分地区。月季花具有很高的观赏价值，也具有很高的药用价值，其性味甘、温，主入肝经，具有活血调经、消肿解毒的功效，临床内服可用于治疗月经不调、经闭、痛经，外敷治疗痈疖肿毒、瘰疬、跌仆瘀肿。何英萍[1]总结相关治疗月经不调经验方发现，月季花3～5朵、黄酒10 g、冰糖适量加水煎服具有行气活血的功效，适用于气滞血瘀所致闭经、痛经等症。月季花中含有多种化合物，如槲皮素、山奈黄素、鼠李糖苷、胡桃苷等，主要含黄酮和酚酸类化合物，同时也是其主要活性成分[2]。近现代药理学研究表明，月季花具有很强的抗菌、抗病毒、抗氧化作用。袁克星等[3]探讨月季花色素对小鼠运动能力及抗氧化能力的影响，发现月季花色素可显著增强小鼠体内多种抗氧酶的活性，提高小鼠运动能力。有文献报道，月季花可抑制肿瘤，具有抗癌作用，同时对增强机体免疫也有显著作用[4]。本实验通过对小鼠反复脑缺血再灌注模型小鼠脑组织匀浆中NO、NOS水平，以及血清中NSE和脑组织含水量的检测，探讨月季花总黄酮对小鼠脑缺血后可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药品

月季花总黄酮：含量(总黄酮)50%，由郑州大学实验中心提供；脑络通胶囊由四川泰华堂制药有限公司提供。

1.2 实验动物

KM小鼠，雄性，SPF级，24～26 g，由河南省实验动物中心提供，合格证号:SCXK(豫)2015-0001。

1.3 实验仪器

UV1000单光束紫外/可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；玻璃匀浆器(郑州玻璃仪器厂)；可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司)；KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海基玮试验仪器设备有限公司)。

1.4 实验试剂

羧甲基纤维素钠(天津市福晨化学试剂厂)；神经元烯醇化酶(NSE)ELISA检测试剂盒(北京诚林生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5 实验方法

取KM雄性小鼠84只，SPF级，实验室适应性饲养3天，称重随机分为6组，即假手术组、模型组、脑络通组(0.75 g/kg)和月季花总黄酮组高、中、低剂量组(0.4 g/kg、0.2 g/kg、0.1 g/kg)，除假手术和模型组外，其余各组给予相应药物，1天1次，连续给药7 d，于第6 d晚八点禁食不禁水12 h，第7 d早给药1 h后进行手术，制造小鼠反复再灌注模型。10%水合氯醛小鼠腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，并仰卧固定于鼠板上，颈部剃毛酒精消毒后正中切口，精密分离双侧颈总动脉(CCA)周围肌肉和神经，穿线备用。用微动脉夹同时夹闭双侧CCA 10 min后，松开微动脉夹，使小鼠脑部恢复供血10 min，再进行第二次夹闭阻断血流10 min，再松开，给予适量青霉素，缝合伤口，于第8 d早上给药1 h后进行取材。注意实验室温度控制在25℃左右，假手术组仅分离双侧CCA但不阻断血流[5]。

1.6 检测指标

1.6.1 血清的制备

各组小鼠缺血再灌注22 h后进行摘眼球取血，静置1 h待血液分层，低温离心10 min，3 500 r/min，移液枪取上层血清冷冻备用，测定血清中NSE水平。

1.6.2 脑匀浆的制备

取血后小鼠脱颈椎处死，迅速剥脑，按矢状线将小鼠脑组织分为两半，切除小脑和嗅球。取其中一半，用冰生理盐水冲净脑组织表面血液，滤纸沾干，精确称取脑组织重量，加入9倍生理盐水充分匀浆，制成10%脑组织匀浆液，低温离心10 min，3 000 r/min，移液枪取上清液冷冻备用，测定脑匀浆中NO、NOS水平。

1.6.3 脑组织含水量测定

取另一半脑组织，冲净表面血迹，滤纸沾干后精密称重，为脑组织重量A(湿重)，将脑组织置于105℃烘箱中连续烘干48 h置恒重，即为重量B(干重)，运用公式计算脑组织含水量[6]。

脑组织含水量(%)=(A-B)/A×100%

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 月季花总黄酮对小鼠反复脑缺血再灌注模型死亡率的影响

除假手术组外，术后其余各组均呈现出不同程度死亡现象。其中，模型组死亡率最高，为28.57%，且模型组动物不同程度出现神经症状缺失现象，精神萎靡，不活跃，甚至出现走路倾倒或意识丧失等现象；阳性药脑络通组相较于模型组，动物术后状态得到大幅度改善，并且死亡率仅为14.29%；月季花总黄酮各组对小鼠不论是术后状态还是死亡率，均有不同的改善作用，其中以月季花总黄酮高剂量组效果最好，死亡率降低至10%以下，且术后动物较为活跃，状态比模型组有很大提升。结果见表1。

表1 各组对小鼠反复脑缺血再灌注模型死亡率的影响

2.2 月季花总黄酮对小鼠反复脑缺血再灌注模型血清中NSE含量的影响

由表2可得，与假手术组相比，模型组小鼠血清中NSE含量大幅升高(P<0.01)，说明小鼠反复缺血再灌注模型造模成功。与模型组相比，阳性药脑络通组可显著下调小鼠血清中NSE水平(P<0.01)，有明显改善作用；月季花总黄酮高剂量组可显著降低小鼠血清中NSE含量(P<0.01)，中剂量和低剂量可明显降低小鼠血清中NSE含量(P<0.05)，说明月季花总黄酮可改善小鼠缺血损伤后血清中NSE水平，高剂量月季花总黄酮效果最佳。

表2 各组对小鼠反复脑缺血再灌注模型血清中NSE含量的影响

注：与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。

2.3 月季花总黄酮对小鼠反复脑缺血再灌注模型脑组织匀浆中NO、NOS水平的影响

由表3可得，与假手术组相比，模型组小鼠脑组织匀浆中NO含量大幅增加，NOS的活性也大幅上调(P<0.01)，提示小鼠反复缺血再灌注模型造模成功。与模型组相比，阳性药脑络通组可显著降低小鼠脑组织中NO的水平(P<0.01)、显著下调NOS活性(P<0.01)；月季花总黄酮各组对NO、NOS也有明显的改善作用，其中高剂量可显著降低脑组织匀浆中NO、NOS水平(P<0.01)，中剂量组可明显降低脑组织匀浆中NO、NOS水平(P<0.05)，低剂量组可明显降低NOS活性(P<0.05)，对脑组织中NO含量有明显降低趋势，但无统计学意义。

2.4 月季花总黄酮对小鼠反复脑缺血再灌注模型脑组织含水量的影响

由表4可得，与假手术组相比，模型组小鼠脑组织含水量显著升高(P<0.01)，提示造模成功。阳性药脑络通组可显著降低缺血损伤后小鼠脑组织含水量(P<0.01)，月季花总黄酮各组对脑组织含水量有明显改善作用，其中高剂量组和中剂量组可降低小鼠脑组织含水量(P<0.05)，低剂量组降低趋势明显，但无统计学意义。结果见表4。

表3 各组对小鼠反复脑缺血再灌注模型脑组织匀浆中NO、NOS水平的影响

注：与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。

表4 各组对小鼠反复脑缺血再灌注模型脑组织含水量的影响

注：与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。

3 讨论

脑血管病(CVD)是当今危害人类生命健康的第三主要原因，仅次于心脏病和恶性肿瘤相关疾病，根据其发病的差异性，可分为缺血性和出血性两种[7]。刘瑛娜等[8]通过对两种不同性质脑卒中的发病情况进行统计分析，脑卒中的发病与年龄、季候有很大关系，40岁以上随年龄增加缺血性脑卒中呈上升趋势，夏季缺血性卒中发病率较高，但总体来说，缺血性脑卒中患病约占脑卒中的七成，如何更好的防治缺血性脑血管疾病是如今CVD研究的重点，本实验通过月季花总黄酮对小鼠反复缺血再灌注模型的作用，探讨月季花总黄酮在防治脑缺血疾病的可能机制。

神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是神经系统特异性蛋白质，含量由高到低依次为脑、脊髓和周围神经节。正常情况下，细胞间质和血液中NSE的水平非常低，在缺血缺氧后，脑组织能量代谢降低，神经元损伤或坏死，NSE从胞内释放，透过血脑屏障进入血液，使血液中NSE含量大幅上调，因此，通过检测血清中NSE含量，能间接判断缺血后脑组织损伤程度，可作为简易血清生物学标志物[9]。实验结果显示，小鼠反复缺血再灌注手术后，模型组小鼠脑组织匀浆中NSE含量大幅升高(P<0.01)，具有极显著性，月季花各给药组可明显降低脑组织NSE含量，说明小鼠反复脑缺血后，月季花总黄酮对神经元可能有保护作用，改善神经元损伤及坏死，减少NSE从胞内释放，血清中含量显著降低，其中高剂量月季花总黄酮组效果较好。

目前，脑缺血的机制大致有能量代谢障碍、自由基反应、炎症级联反应、兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载等，而NO和NOS在脑缺血损伤中的作用和机制也越发引起关注。经研究，NO是机体中重要的信使和效应分子，参与机体生理病理活动。在脑缺血发生后，根据产生NO细胞的类型和产生过程条件的不同，NO发挥保护和损伤的双重作用[10]。

在脑缺血损伤过程中，NO和NOS主要起神经毒性的作用。在脑缺血缺氧早期，eNOS活性上调，产生的NO可扩张脑血管，增加脑组织血流量，发挥保护作用[11]，但这种保护作用仅在数小时短时间内，随着缺血程度的不断加深，iNOS在中晚期大量表达，起到神经毒性作用[12]。脑缺血后通过抑制NO和NOS，可改善脑组织的损伤以及神经细胞凋亡[13]。由实验结果可得，在小鼠反复脑缺血再灌注22 h后，模型组小鼠脑组织中NO、NOS水平均大幅升高(P<0.01)，产生的大量NO以及NOS活性上调，均会加重缺血损伤，月季花总黄酮各组具有明显降低脑组织中NO和NOS水平的趋势，由此可推断，月季花总黄酮可能通过降低NO和NOS水平来减轻缺血缺氧后脑组织神经毒性作用，对神经细胞起到保护作用。

脑缺血再灌注时，产生大量炎症因子和自由基，兴奋性氨基酸、细胞钙离子超载、血管活性物质作用等均可造成脑组织水肿，脑组织含水量可反映脑水肿程度[14]，同时也可反映药物对脑缺血再灌注损伤的保护作用[6]。由实验结果得，与假手术组相较，模型组脑组织含水量大幅升高(P<0.01)，说明小鼠脑缺血术后组织水肿严重，月季花总黄酮对小鼠脑水肿有很好的改善作用，有明显减低的趋势，提示月季花总黄酮可通过改善脑水肿对小鼠脑缺血起到保护作用，以月季花总黄酮高剂量组效果最佳。

综上，月季花总黄酮可以显著降低小鼠反复再灌注模型血清中NSE含量、脑组织匀浆中NO和NOS水平、减轻缺血后脑水肿，对脑缺血起到改善作用，以高剂量效果最佳。