白露汤含药血清对人肺癌A549细胞活力、凋亡及周期的影响

朱紫薇，周忠光，韩玉生

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

肺癌是全球范围内患病率和死亡率最高的恶性肿瘤，也是人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。肺癌有多种病理分型，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%以上[2],肺腺癌占非小细胞肺癌的50%。从肿瘤细胞学方面来看，肺癌发生的本质在于细胞异常增殖与凋亡的调节失控有关[3]。中医典籍中并无肺癌这一直接病名，但根据肺癌的临床症状和体征，本病的相关论述散见于 “肺岩”“胸痛”“咯血”“息贲”“肺萎”“肺痈”等证的范畴。可见正气不足在先，继而痰、湿、气、瘀、热、毒搏结为患，本虚标实贯穿始终，故治疗上以扶正祛邪为基本原则[4]。纵观各医家之论，治法多以扶正培本、解毒散结、化痰祛湿、活血化瘀为主。白露汤为自拟方剂，是在临床治疗肺癌过程中确立，疗效确切，具有扶正解毒、清肺消肿的功效。方中灵芝[5]补气、止咳、平喘，露蜂房散结解毒，白僵蚕化痰散结、止痉止痛，干蟾皮清热解毒[6]、利水消肿[7]。四药合奏显现中药的抗癌的优势，可对肺癌细胞的增殖周期进行调控与诱导凋亡[8]。本研究观察了白露汤含药血清对人肺癌A549细胞活力、凋亡及生长周期的影响，现报告如下。

1 材料

1.1 细胞株培养

人肺腺癌细胞株A549购于武汉博士德生物工程有限公司。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM的培养液中。培养环境为37℃，恒温培养箱中通入5% CO2饱和湿度培养，2～3天进行一次换液传代(用胰酶进行消化传代)。

1.2 药物

白露汤中灵芝、白僵蚕、露蜂房和干蟾皮4种药物饮片均购于黑龙江省哈尔滨市医药药材总公司，经黑龙江中医药大学中医药研究院鉴定为正品。上述中药饮片由黑龙江中医药大学实验实训中心制备，生药含量为0.9 g/mL。

1.3 仪器

二氧化碳培养箱HF-90(上海力申)；多功能酶标仪M200PRO(瑞士TECAN 公司)；超速冷冻离心机H-2050R(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；电热恒温培养箱DH36001B(天津泰斯特)；倒置相差显微镜AE31(麦克奥迪)；电泳仪及垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)。

1.4 试剂

胎牛血清(BI公司，美国，货号04-001-1ACS)； RPMI1640培养液(Gibco公司，美国，货号12100-46)； CCK8试剂盒(万类生物公司，中国，批号WLA074b)；噻唑蓝、蛋白酶抑制剂、顺铂(Sigma 公司，美国)；细胞凋亡溴化乙啶(EB)染色试剂盒(南京凯基)；Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒(上海晶美)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(万类生物公司，中国)；RIPA裂解液， HIF-1α等抗体(万类生物公司，中国)；β-肌动蛋白(β-actin) 兔单克隆抗体，抗 EGFR 兔单克隆抗体、HRP-羊抗兔 IgG 酶标二抗(全式金公司，中国北京)。

2 方法

2.1 细胞分组

将培养好的细胞随机分为空白对照组，白露汤低、中、高剂量含药血清组(简称低、中、高剂量组)，阳性药组(即顺铂组)。做好标记，并分别加入对应的溶剂。

2.2 含药血清的制备

给予大鼠灌服处理过的白露汤，按照25 mL/kg的剂量灌胃给药，每天2次，连续7天。末次给药前禁食12 h，于末次给药1 h后，大鼠腹主动脉取血。室温下静置30 min，取上清液3 000 rpm离心15 min，于56℃水浴中灭活30 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜备用。

2.3 低、中、高含药血清的配比

低剂量的含药血清是药物血清与正常DMEM培养基以1∶40体积配比；中剂量的含药血清是药物血清与正常DMEM培养基以1∶20体积配比；高剂量的含药血清是药物血清与正常DMEM培养基以1∶10体积配比。

2.4 CCK-8检测

白露汤低、中、高剂量组，顺铂组与空白对照组含药血清，用DMEM培养基稀释，使含药血清的体积分数达10%(V/V)[8-9]；将培养好的人肺腺癌A549细胞接种于96孔板，每孔100 μL，孵育培养24 h，待细胞贴壁后弃去原培养液，每孔加入配制好的不同组别的含药血清各100 μL，每组平行设置5个复孔；置于孵箱内培养24 h，48 h，72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h；然后置于酶标仪中检测，在波长450 nm处测定吸光度值(OD)，每组重复3次,计算细胞活力(%)。

细胞活力=(实验组OD-空白调零组OD)/(空白对照组OD-空白调零组OD)×100%

2.5 Western-blot检测

显微镜下观察白露汤作用24、48 h后的人肺腺癌A549细胞活性变化; 收集细胞，RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白;采用BCA法测蛋白浓度;分别加入一抗Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α(1∶500)，于脱色摇床上孵育2 h，TBST液洗膜3次，加入HRP-羊抗兔IgG酶标二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST液洗膜3次，加入发光剂，去除多余液体，在暗室中用X胶片感光，显影，定影;采用凝胶成像仪扫描胶片，用Image-Pro Plus软件分析各条带的灰度值，将各组Bax、Bcl-2、C-caspase、HIF-1α与其β-actin灰度值比值作为蛋白相对表达量。

2.6 流式细胞仪检测

收集培养的细胞，药物作用结束后，吸除培养液，PBS冲洗2次，细胞胰酶消化，离心，去上清，PBS清洗2次，加入PI染液，4℃室温避光30 min后上机检测，记录红色荧光值，每组重复操作3次。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 细胞活力的比较

经检测显示，空白对照组与各浓度含药血清组的细胞存活率之间存在统计学差异(P<0.05)。白露汤各浓度给药组与空白对照组在24 h、48 h、72 h后比较，人肺腺癌A549细胞活力逐步下降，差异有统计学意义(P<0.05)。但各浓度含药血清组之间的差别无统计学意义(P>0.05)。结果表明，低、中、高剂量白露汤含药血清在24 h、48 h、72 h均对A549细胞活力有抑制作用，并且含药血清浓度越高抑制作用越强，随着作用时间的延长抑制作用也逐渐增强。结果见图1。

注：与空白对照组比较，＊P<0.05；与顺铂组比较，＊P<0.05。图1 各组对A549细胞活力的影响

注：A：空白对照组；B：顺铂组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组。图2 Western blot检测Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α蛋白表达

3.2 对A549细胞凋亡的影响

经计算低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为41.9%、64.9%、73.1%，说明白露汤含药血清各给药组均可以不同程度增强诱导A549细胞凋亡。与空白对照组比较，各剂量组A549细胞中的Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α的蛋白表达均显著变化(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达明显下调，Bcl-2/Bax的表达尤其显著。各蛋白变化的趋势与含药血清药物浓度有关。同时，差异有统计学意义。结果表明，白露汤含药血清各浓度组均能诱导A549细胞凋亡，且随药物浓度的增加凋亡的数目随之增加。结果见表1和图2。

表1 白露汤含药血清对A549细胞凋亡的影响

注：与空白对照组比较，＊P<0.05。

3.3 对A549细胞周期的影响

与空白对照组比较，白露汤中、高剂量组含药血清作用24 h可影响A549细胞各周期的分布，G0/G1期细胞比例显著提高(P<0.05)；S期细胞比例显著降低(P<0.05)；G2/M期细胞比例降低，但无显著性差异(P>0.05)。结果表明，白露汤能阻滞A549细胞周期于G0/G1期，且与剂量浓度正相关。结果见表2。

表2 白露汤含药血清24 h对A549细胞周期的影响

注：与空白对照组比较，＊P<0.05。

4 讨论

非小细胞肺癌5年的生存率低于15%，大部分以晚期为主[7]。肺癌晚期治疗多以放、化疗为主，但对患者可以产生不同程度的毒副作用。研究证实，肿瘤的发生与发展是细胞的异常增殖和调控失控导致的[10-11]。而抑制肿瘤细胞的增殖是治疗肿瘤的关键途径。诱导肿瘤细胞凋亡也是抗肿瘤的一种重要机制[12]。Bcl-2家族蛋白对细胞凋亡有调节作用，一类是Bcl-2为代表的抗凋亡蛋白，另一类是Bax为代表的促凋亡蛋白。所以，Bcl-2家族蛋白就是凋亡的关键靶点[13]。白露汤为清肺解毒药，中药复方的含药血清是经过体内吸收代谢的产物，避免了中药复方本身因制作工艺产生的干扰和非特异性理化因素对细胞作用的假阳性，可保证结果的真实性和可靠性。本研究结果表明，不同浓度的白露汤含药血清对A549细胞的活力均有抑制作用，与药物浓度、药物作用时间相关；白露汤含药血清作用A549细胞的作用是多靶点、多环节、多效应、多途径的。各浓度含药血清作用A549的24 h后，可显著影响Bcl-2家族蛋白的表达，同时含药血清中、高剂量组的G2/M期细胞比例也明显阻滞[14]。综上所述，本试验的研究发现，白露汤可抑制人肺癌A549细胞的活力、影响其细胞周期、主动诱导肿瘤细胞凋亡。并且中医药治疗不易产生耐药性，可调节增强肺癌患者的免疫情况，对肺癌的治疗综合效果良好，但具体的抗肿瘤机制以及抗肿瘤作用的物质基础将在后续继续研究。