自制新型支气管肺泡灌洗导管装置在周围型肺癌诊断中的应用

陈菁，刘旭，杨硕，罗光伟

(武汉市第一医院，武汉430022)

目前，临床常用的肺癌病理诊断方法有痰脱落细胞检查、纤维支气管镜检查、经皮穿刺肺活检以及支气管肺泡灌洗术(BALF)等[1～6]。其中，痰脱落细胞检查是惟一无创的病理诊断方法，但阳性率明显偏低；纤维支气管镜检查是常用的病理检查手段，中央型肺癌的确诊率可达100%，但对于周围型病变确诊率仅在20%～65%[7]；经皮穿刺肺活检经过多年的改进和完善已成为肺癌尤其是周围型肺癌病理诊断的主要手段[8]，但该法易导致气胸、出血等并发症。BALF阳性细胞检出率较痰脱落细胞检查显著增高[9,10]，且辅以液基细胞学检测(LCT)对传统涂片检查的改进，使该法在临床上的应用越来越多。p63和甲状腺转录因子1(TTF-1)分别为诊断肺鳞癌和腺癌的特异性分子标志物，可用于肺癌的分型诊断。近年来，我们团队针对BALF检查方法进行改进，设计了一种新型支气管肺泡灌洗导管(专利号：201720265388.7)，以进一步提升该检查方法在周围型肺癌患者病理组织学诊断中的应用价值。本研究分别应用传统和自制新型支气管肺泡灌洗装置对周围型肺癌患者进行BALF检查，比较了在引起患者不适反应、采集的细胞质量、诊断的准确性等方面的差异，以验证该装置对BALF检查的改善提升作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年8月～2017年2月，在通过结合患者主诉与影像学分析初步判定为肺癌的患者中，对其中适于应用BALF检查者分别选用传统支气管肺泡灌洗导管装置和自制新型导管装置进行检查。纳入术后组织病理学检查确诊为周围型肺癌者121例，男93例、女28例，年龄37～75岁，鳞癌82例、腺癌39例。其中，使用传统灌洗装置者74例(对照组)，男56例、女18例，年龄39～75岁，腺癌22例、鳞癌52例；使用自制新型灌洗装置者47例(观察组)，男37例、女10例，年龄37～72岁，腺癌17例、鳞癌30例。两组性别、年龄及病理类型具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 BALF检查及患者不适反应观察 按照中华医学会制定的《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)》，使用传统或自制新型支气管肺泡灌洗导管装置进行检查。检查获得的病理标本部分用于LCT制片，部分冻存于液氮中以备PCR检测。同时，记录患者行BALF检查过程中及检查后出现的不适反应。自制新型支气管肺泡灌洗导管装置，见图1。

注：灌水口(1)，进水导管(2)，出水孔(3)，吸水孔(4)，吸水导管(5)，回收口(6)，硅胶乳头(7)，储水仓(8)，回收导管(9)，负压导管(10)，负压泵(11)，连接件(12)，注射器(13)；进水导管(2)和吸水导管(5)在连接件(12)内分别汇合成一支直径为2 mm的总导管；吸水孔(4)的高度位于出水孔(3)的下侧。

图1 新型支气管肺泡灌洗导管示意图

1.3 LCT检查 取部分BALF检查获得的病理标本，离心后进行LCT制片；以95%乙醇固定15 min，分别经苏木素和橙黄染液染色；脱水、透明后进行封片，常规巴氏染色；由2位病理科医师同时显微镜下拍照、阅片、判读，并观察制片细胞的数量和质量。

1.4 TTF-1、p63 mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。取冻存于液氮中的剩余部分BALF，提取总RNA并定量；于M-MLV逆转录酶作用下，以随机引物逆转录合成cDNA；以cDNA产物为模板，进行Real-time PCR扩增目的基因片段。TTF-1上游引物5′-CGTTCTCAGTGTCTGACATCTTGA-3′，下游引物5′-CCTCCATGCCCACTTTCTTG-3′；p63上游引物5′-GGAAAACAATGCCCAGACTC-3′，下游引物5′-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′，下游引物5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′；反应条件：95 ℃预变性5 min，按95 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循环35次。实验重复3次，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法分析TTF-1和p63 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 两组BALF检查不适反应比较 观察组未出现不适反应；对照组出现不适反应共6例(8.1%)，其中仅出现胸痛4例，兼有咳嗽、发热、胸痛2例(其中1例发生出血)。观察组不适反应少于对照组(P=0.048)。

2.2 两组LCT制片细胞数量和质量、诊断肺癌及其分型的准确性比较 观察组细胞铺片比较分散、均匀，肿瘤细胞很清楚；对照组多出现炎性细胞较多，分布不均匀，肿瘤细胞难以分辨。低倍镜下(100×)，单视野观察组肿瘤细胞数量为(76±12)个，高于对照组的(25±18)个(P=0.002)。观察组检出腺癌13例(76.5%)、鳞癌26例(86.7%)、总检出率83.0%，对照组检出腺癌14例(63.6%)、鳞癌31例(59.6%)、总检出率60.8%，观察组鳞癌、肺癌总检出率均高于对照组(P均=0.010)。

2.3 两组灌洗细胞中TTF-1、p63 mRNA表达水平对肺鳞癌和腺癌诊断价值的比较 见表1。

表1 两组灌洗细胞中TTF-1、p63 mRNA表达比较

注：与同组腺癌比较，*P<0.01。

ROC分析显示，对照组以0.303为p63 mRNA诊断肺鳞癌的界值，其诊断灵敏度为0.860、特异度为0.873；以0.287为TTF-1 mRNA诊断肺腺癌的界值，其诊断灵敏度为0.873、特异度为0.808。观察组以0.229为p63 mRNA诊断肺鳞癌的界值，其诊断灵敏度为0.921、特异度为0.915；以0.204为TTF-1 mRNA诊断肺腺癌的界值，其诊断灵敏度为0.880、特异度为0.903。与对照组比较，观察组采集的标本检测结果两指标临界值有所下调，但灵敏度和特异度均提高。

3 讨论

越来越多的证据表明，肺腺癌和鳞癌有明显的致癌性突变和不同的治疗反应，这就推动了非小细胞肺癌(NSCLC)精确的病理分型。例如，贝伐单抗禁用于鳞癌，这种药物增加鳞癌患者的肺出血风险。肺癌分型已成为治疗的关键，可指导个性化治疗。目前，除在术后对手术切除病理组织进行常规病理检查作为病理分型的金标准外，临床还有在术前对病理诊断的迫切需求。BALF检查创伤轻微且不良并发症较少，因而被广泛应用。

BALF是通过纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，反复以无菌生理盐水灌洗、回收，对其进行一系列检测和分析，从而获得下呼吸道病变的性质特点和活动程度，有助于明确诊断。传统方式通过一根导管将生理盐水注入人的支气管肺泡内，通过内腔镜观察水位，当支气管肺泡充满水后才能进行回收，因此易造成患者呛水咳嗽以及回收不充分；该操作必须大量灌入生理盐水，因此对医师的技术要求特别高；而且，充水后生理盐水会流向其他地方，回收的生理盐水也有被其他地方污染的情况，无法进行精确的病理查找。

本研究应用拥有实用新型发明专利的自制新型灌洗导管装置，目的在于解决现有装置在应用中易出现的问题。该装置有进水导管，其顶端开有灌水口，灌水口上接通有注射器；进水导管的端部固定安装在连接件的内腔中，连接件的内腔中还设有吸水导管；吸水导管的顶端设有回收口，回收口的顶端螺纹连接有回收导管；回收导管的端部延伸至储水仓的内腔中，储水仓的内腔中还插接有负压导管；所述进水导管和吸水导管在连接件内分别汇合成一支总导管(直径2 mm)，其底端密封套接有硅胶乳头；硅胶乳头的一侧开有出水孔，另一侧开有吸水孔，且吸水孔的高度位于出水孔的下侧。与现有技术相比，该装置中直径2 mm的总导管插入时，人体的不适感减弱；硅胶乳头的设置，防止主导管的端部对肺泡造成伤害；回收导管将人体肺泡内的积水抽出，暂经过储水仓储存；控制负压泵工作，通过负压导管将储水仓内的积水抽出，从而避免回收不充分。本研究结果显示，观察组未引起不适反应，大大提高了BALF检查灌洗的效率；所收集的细胞标本制片后，细胞铺片比较分散、均匀，肿瘤细胞很清楚，镜下视野中肿瘤细胞数量显著增多；而对照组所获细胞样本制片后出现炎性细胞太多、分布不均匀、肿瘤细胞难以辨别等情况，可见新型装置所得灌洗细胞质量明显优于传统装置。并且，应用不同装置采集的病理标本进行LCT制片，新型装置采集的标本肺癌检出率更高。

研究表明，肺腺癌和鳞癌几乎不重叠共表达TTF-1和p63[11，12]。因此，本研究以二者作为判定周围型肺癌病理分型的标志物，在灌洗细胞样本中采用Real-time PCR法对其表达水平进行检测，结果表明二者在腺癌和鳞癌两种病理分型中呈现明显的分化表达趋势；以表达水平对肺腺癌和鳞癌两种病理分型进行诊断，发现应用新型装置采集的灌洗细胞样本检测分子指标的表达水平进行诊断，可明显提高诊断的灵敏度和特异度，诊断价值优于传统灌洗装置。

综上所述，本研究表明自制新型支气管肺泡灌洗导管装置用于BALF检查，可以有效降低灌洗过程中患者的不适感，提高了灌洗的效率，采集到的灌洗细胞样本质量好，用于分子标志物表达水平检测进行肺癌分型时具有更好的诊断价值，适宜在临床推广应用。