硝化抑制剂对紫色土硝化作用及N2O排放的影响

赖晶晶，兰 婷，王 启，谭春林，李梦潇

（四川农业大学资源学院，成都 611130）

硝化作用是土壤微生物将铵盐氧化为硝酸盐并产生氮氧化物的过程，通过与不同氮转化过程的耦联，共同决定着土壤生态系统中的氮平衡[1]。作为土壤氮循环的中心环节，硝化作用不仅影响植物和土壤微生物对氮素的有效利用程度，而且与过量氮肥投入导致的硝酸盐淋失、土壤酸化、水体污染和温室气体（如氧化亚氮N2O）排放等一系列生态环境问题直接相关[2]。N2O作为一种温室气体，其增温能力约为CO2的298倍，也是导致臭氧层破坏的主要气体[3]。目前，全球范围内人为活动造成的N2O排放量有60%～80%来自于农业生产，而硝化过程是农业土壤中N2O的主要来源[4]。

目前，有关提高氮肥利用率的原理和技术已取得较大进展[5]，其中，施用硝化抑制剂不仅能抑制氮在土壤中的硝化过程，还能减少反硝化作用底物浓度，从而降低NO-3的反硝化损失以及硝化-反硝化过程的N2O产生[6]，被认为是提高氮肥利用率的有效措施之一[7]。双氰胺（Dicyandiamide，DCD）和3，4-甲基吡唑磷酸盐（3，4-dimethylpyrazole phosphate，DMPP）是目前广泛应用的硝化抑制剂，发展和研究已经较成熟，具有低成本、不易挥发和便于施肥等特点[8]。通过底物竞争干扰氨氧化微生物，DCD能抑制10%～57%的硝酸盐淋失和11%～47%的N2O排放[9]，而文献报道DMPP用量仅为DCD的1/10时，其抑制效果便能高于DCD[10]。2-氯-6-三氯甲基吡啶[2-chloro-6-（trichloromethyl）pyridine，Nitrapyrin]以螯合氨氧化酶活性位点的方式抑制硝化作用[8]，施用于美国100万hm2以上的耕地，其中约90%为中西部玉米种植区，硝化抑制率达18.5%～91.4%[11]，表现出明显的增产效果[12]。生物硝化抑制剂是近年来发现的具有较强硝化抑制能力的植物根系分泌物，其中高粱根系分泌的对羟基苯丙酸甲酯[Methyl 3-（4-hydroxyphenyl）propionate，MHPP]能通过影响氨氧化微生物酶活性抑制硝化作用[13]，但目前几乎尚未在农业生产中应用，且相关研究还处于起步阶段。然而，其环境友好生态效益使之具有良好的发展潜力和推广意义[14]。

紫色土是亚热带地区的一种非地带性土壤，在我国广泛分布于长江上游丘陵地区，是中国南方重要的旱作土壤之一[15]。由于发育程度浅，紫色土继承了紫色砂岩页岩疏松且易被侵蚀的特点，温暖湿润的气候条件更使紫色土土壤微生物活性高。四川地区紫色土pH值少部分呈中性或酸性，而大部分呈碱性，因此硝化作用和硝酸盐淋溶强烈[16]。有关各种硝化抑制剂的应用效果和筛选已有较多研究，但除气候环境和农业管理方式以外，土壤类型与硝化抑制剂的作用效果密切相关[17]。不同土壤含有的氨氧化微生物优势类群不同，而微生物对各种硝化抑制剂的敏感程度及响应也不同，因此硝化抑制剂的作用效果在不同土壤中存在差异[18]。硝化抑制剂，尤其是生物硝化抑制剂对紫色土硝化过程及N2O产生的作用效果尚未明确。本研究通过开展室内培养试验，探讨4种硝化抑制剂（DCD、DMPP、Nitrapyrin、MHPP）对四川地区石灰性紫色土无机氮含量、硝化速率及N2O产生速率变化特征的影响，并以酸性紫色土作对比。以期揭示上述4种硝化抑制剂对石灰性紫色土和酸性紫色土的硝化作用及N2O排放的影响，为田间条件下进一步验证及制定减排措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试的石灰性紫色土和酸性紫色土于2018年4月分别采自四川遂宁和四川乐山。遂宁属亚热带季风气候，热量充足，雨量充沛，湿度大且云雾多。无霜期长达283～300 d，年平均气温为16.7～17.4 ℃，年平均降水量为887.3～927.6 mm，年蒸发量为910.7～1 128.3 mm，土壤类型为石灰性紫色土，发育于侏罗纪中统遂宁组。乐山属中亚热带季风气候，气候湿润，雨量充沛，无霜期长达300 d以上，大部分地区年平均降水量在1000 mm以上，年平均气温为16.5～18.0℃，土壤类型为酸性紫色土，母质为白垩纪夹关组。供试土壤采自耕地表层土壤（0～20 cm），剔除杂质后过2 mm筛，贮存于4℃环境下备用，基本理化性质见表1。

1.2 供试材料

氮肥采用NH4Cl（国药集团，优级纯），供试硝化抑制剂分别为:双氰胺（DCD，Solarbio公司）、3，4-甲基吡唑磷酸盐（DMPP，西宝生物科技股份有限公司）、2-氯-6-三氯甲基吡啶（Nitrapyrin，Solarbio公司，纯度98%+）、对羟基苯丙酸甲酯（MHPP，Adamas公司，纯度98%+）。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Properties of the studied soils

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

试验分两组:第一组供试土壤为石灰性紫色土（SN），第二组为酸性紫色土（LS）。两组各设5个处理:1个对照处理和4个硝化抑制剂处理，每个处理设置3个重复。即:①CK处理（NH4Cl）；②DCD处理（NH4Cl+DCD）；③DMPP处理（NH4Cl+DMPP）；④Nitrapyrin处理（NH4Cl+Nitrapyrin）；⑤MHPP处理（NH4Cl+MHPP）。结合文献中普遍采用的硝化抑制剂浓度[9，19-20]、厂家推荐用量以及前期预备试验筛选的最佳浓度，设定氮肥和硝化抑制剂的用量，其中，各处理NH4Cl的加入量均为50 mg N·kg-1，DCD、DMPP、Nitrapyrin和MHPP的加入量分别为加入NH+4量的10%、1%、1%和10%。

采用室内培养试验，称取相当于40 g干土质量的鲜土置于400 mL塑料瓶中，加蒸馏水调节土壤含水量至30%WHC（田间最大持水量），25±1℃恒温避光预培养3 d后，用移液枪逐滴加入相应浓度的NH4Cl溶液和硝化抑制剂溶液2 mL，使之尽可能均匀分布于土壤中。添加蒸馏水调节土壤含水量至60%WHC，轻盖瓶口创造好氧条件，继续在25±1℃环境下恒温避光培养。培养期间每日打开瓶盖30 min，更新瓶中气体，并称重加水使土壤含水量保持在目标水平。

各处理分别在加入NH4Cl和硝化抑制剂溶液后的1、2、3、4、5、7、10、14 d进行气体样品采集，每次采集气样前密闭塑料瓶8 h，用20 mL注射器反复抽提瓶内气体5次混匀气体然后取20 mL气体样品注入18.5 mL真空瓶，用于测定N2O浓度。气体采集之后，从各处理中随机取出3个塑料瓶进行破坏性取样，加入200 mL 2 mol·L-1的KCl溶液，25 ℃、250 r·min-1下振荡1 h后过滤，测定过滤液中NH+4-N和NO-3-N浓度。

1.3.2 测定方法

土壤基本理化性质采用常规方法测定[21]。过滤液中的NH+4-N和NO-3-N浓度采用全自动间断化学分析仪（DeChem-Tech.Gmbh，CleverChem 380，Germany）测定。气体N2O浓度用安捷伦气相色谱仪（Agilent 7890A，Agilent Technologies，Inc.，USA）测定。色谱柱为80/100目的Porapak填充柱，进样口、柱温和检测器温度分别为100、65℃和300℃。载气为亚甲烷（95%氩气+5%甲烷），流速为40 mL·min-1。标准气体由中国国家标准物质中心提供。

1.3.3 计算公式

土壤氮硝化速率:

式中:RN为硝化速率，mg·kg-1·d-1；t为间隔时间，h；（NO3--N）0和（NO3--N）t分别为0、t时的NO-3-N浓度，mg·kg-1。平均硝化速率根据时间加权计算得出。

土壤N2O产生速率:

式中:F为N2O产生速率，µg N2O-N·kg-1·h-1；ρ为标准状态下N2O的密度，1.25 kg·m-3；V为塑料瓶内有效空间的体积，m3；W为干土的质量，kg；Δc为采气前后瓶内N2O气体的浓度差，mg·kg-1；Δt为间隔时间，h；T为培养时瓶内温度，℃。气体的平均产生速率根据时间加权计算得出。

硝化抑制剂对硝化速率或N2O产生总量的抑制率:

式中:IR为抑制剂对硝化速率或N2O产生总量的抑制率，%；ACK和AX分别为对照处理和各抑制剂处理土壤的硝化速率或N2O产生总量，mg·kg-1·d-1/µg N2O-N·kg-1。N2O产生总量根据各时间段气体的平均产生速率进行时间加权计算得出。

1.4 数据分析

数据采用SPSS 22.0软件进行统计与分析，其中，不同硝化抑制剂处理氮硝化速率和N2O产生速率的差异比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey检验。图表用Origin 9.0和Excel制作。

2 结果与分析

2.1 不同硝化抑制剂处理下土壤无机氮含量变化特征

加入氮肥和各硝化抑制剂后，两种土壤中NH+4-N含量随着培养时间的延长均呈现下降的趋势，但下降程度受土壤性质和硝化抑制剂影响而有所差异（图1a和图1b）。其中，石灰性紫色土CK处理NH+4含量至培养第4 d已被消耗99%，消耗速度快于相应酸性紫色土的CK处理。与CK处理相比，硝化抑制剂DCD和DMPP的加入并未显著抑制石灰性土壤NH+4-N的消耗速度（图1a），而Nitrapyrin和MHPP处理在培养至第10 d时对石灰性紫色土中NH+4-N的消耗表现出显著抑制（P＜0.05），但抑制效果随培养时间再延长而不显著（P＞0.05）。酸性紫色土中，与CK处理相比，各硝化抑制剂处理在培养0～3 d期间未明显抑制NH+4-N的消耗，但是，CK处理的土壤NH+4-N含量在培养第3 d后始终低于其余各硝化抑制剂处理（图1b）。其中，Nitrapyrin处理在培养前4 d相较其余硝化抑制剂处理表现出对NH+4消耗的较强抑制效果，而MHPP处理在第4 d后的抑制作用显著高于其余各处理（P＜0.05）。

石灰性紫色土中（图1c），CK和DCD处理土壤的NO-3-N含量在第2～3 d显著升高（P＜0.05），DMPP处理也持续升高，Nitrapyrin和MHPP处理先小幅度升高后从第5 d开始下降，最终两者NO-3-N含量的降幅均为39%。酸性紫色土中，各处理土壤NO-3-N含量在培养的前5 d无明显变化，只保持小幅度升高（图1d），5 d后CK及DCD、DMPP处理NO3--N含量显著升高（P＜0.05），而Nitrapyrin和MHPP处理持续下降，直至培养结束。

2.2 不同硝化抑制剂处理下土壤硝化速率变化特征

从表2可以看出，CK和DCD处理的土壤氮硝化速率在石灰性紫色土上第2～3 d时段达到最高值，CK处理的酸性紫色土硝化速率在第4～5 d时段最高，DCD处理的酸性紫色土以及DMPP处理的两种紫色土硝化速率均在培养期各时间段内无显著差异（P＞0.05）。Nitrapyrin和MHPP处理在两种紫色土中的硝化速率都在第0～1 d时段达到最高值，后持续降低至负值。通过时间加权计算得出第0～14 d各处理下的平均硝化速率。其中，石灰性紫色土CK和DCD、DMPP处理的平均硝化速率显著高于Nitrapyrin和MHPP处理（P＜0.05）。酸性紫色土中，CK处理的平均硝化速率显著高于其余各处理，而DCD和DMPP处理间无显著差异，Nitrapyrin和MHPP处理均显著低于其余各处理（P＜0.05）且两者间无显著差异（P＞0.05）。

石灰性紫色土中，DCD处理对硝化速率的抑制率在0～3 d期间为14%，而后保持在6%不变；DMPP处理的抑制率随培养时间的延长由58%降至9%；Nitrapyrin和MHPP处理的抑制率则在第0～3 d期间分别达到91%和93%后不断升高。酸性紫色土中，在0～3 d时各处理对硝化速率的抑制率均为负值，整个培养期DCD和DMPP处理抑制率分别为59%和41%，高于在石灰性紫色土中的抑制率。而Nitrapyrin和MHPP处理的抑制率在两种土壤中均高于DCD和DMPP处理，且在石灰性紫色土中的抑制率高于酸性紫色土。

图1 各处理土壤NH+4-N、NO-3-N含量的变化Figure 1 Evolution of soil NH+4-N and NO-3-N content in different treatments

表2 不同时间段各处理下的土壤硝化速率及其硝化抑制率Table 2 Soil nitrification rate and inhibitory efficiency of nitrification inhibition in different treatments during different incubation periods

2.3 不同硝化抑制剂处理下土壤N2O排放速率变化特征

从图2a可以看出，石灰性紫色土中，CK处理N2O的排放峰出现在第1 d和第7 d。DCD和DMPP处理的N2O产生速率在第1～4 d小于CK处理但大于Nitrapyrin和MHPP处理，其N2O排放在第5 d达到峰值且显著高于其他处理（P＜0.05）。Nitrapyrin和MHPP处理N2O产生速率的变化趋势相似，在培养第0～5 d期间均保持较低水平，而在第7 d达到其最高值后又持续下降。酸性紫色土中，各处理N2O产生速率均在第1 d达到最高值，且以CK处理速率最高，DCD处理最低（图2b），随后培养期内CK处理分别在第3 d和第10 d出现排放峰。与CK处理相比，各硝化抑制剂处理N2O产生速率均在较低水平范围波动，整个培养期内，以Nitrapyrin和MHPP处理N2O产生速率最低，且二者间无显著差异（P＞0.05）。

2.4 N2O平均产生速率及硝化抑制剂对N2O产生总量的抑制率

通过对各处理整个培养期的N2O产生速率进行时间加权，得出N2O平均产生速率。结果表明，石灰性紫色土和酸性紫色土中，CK处理的平均N2O产生速率分别为244.11、46.37 mg N2O-N·kg-1·h-1，添加硝化抑制剂不同程度降低了两种供试土壤中N2O的排放。其中，均以Nitrapyrin和MHPP处理降低效果最明显（图3a）。两者在石灰性紫色土中分别抑制了70%和76%的N2O产生总量，其中MHPP处理显著高于DCD和DMPP和处理，DCD的抑制效果最低，为46%（图3b）。酸性紫色土中，各硝化抑制剂处理对N2O产生的抑制率为32%～54%，且各硝化抑制剂处理间无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 硝化抑制剂对硝化过程的影响

本研究加入氮肥和各硝化抑制剂处理后土壤NH+4-N含量降低而NO-3-N含量升高，表明NH+4-N经硝化作用氧化为NO-3-N。文献报道土壤pH值越高硝化作用越强，NH+4在碱性土中的稳定性低于酸性土[22]，这可能是本研究中石灰性紫色土NH+4-N含量消耗速率明显高于酸性紫色土的原因。不同硝化抑制剂处理下两种土壤NH+4消耗速度和NO-3产生速度均低于CK处理，可见4种硝化抑制剂均能减缓两种土壤中NH+4向NO-3的转化。其中，Nitrapyrin和MHPP在两种土壤中对土壤硝化速率的抑制率均高于DCD和DMPP。尽管有研究表明DMPP对硝化作用的抑制效果好于DCD[23]，但是，Chen等[20]的研究表明，DCD和DMPP对土壤净硝化速率的抑制率分别为60%和66%（硝化抑制剂使用剂量与本研究一致），二者无明显差异，这与本研究结果相似。Nitrapyrin和MHPP在两种土壤中都表现出对硝化作用和N2O产生的较高抑制率，但Nitrapyrin处理在酸性紫色土中的优势只表现在培养前3 d，这可能与其挥发和分解有关[24]。而MHPP作为一种弱的有机酸，在碱性环境中易解离成阴离子[25]。Nardi等[19]的研究发现MHPP加入土壤后仅在第3～7 d对NH+4有固定作用，且微生物在第3 d即开始分解MHPP。如果在田间条件下，植物根系能够持续分泌生物硝化抑制剂，那么比起易挥发或易分解的合成硝化抑制剂，生物硝化抑制剂在作用时间上显然更占优势[26]。

图2 各处理土壤N2O产生速率的变化Figure 2 Evolution of soil N2O production rate in different treatments

图3 各处理土壤N2O平均产生速率及硝化抑制剂对N2O产生总量的抑制率Figure 3 The average of soil N2O production rate and the inhibitory efficiency of nitrification inhibition on total N2O production in different treatments

Nitrapyrin和MHPP处理的土壤NO-3-N含量在培养后期下降且硝化速率降为负值，这不仅是因为硝化抑制剂对硝化作用的抑制降低了NO-3的产生，还与土壤中NO3-的消耗密切相关。NO-3的消耗过程包括反硝化作用、无机氮的微生物同化、非生物固定等[27]。吴晓荣等[28]的研究认为，Nitrapyrin可能因为其含有易分解的碳源，能直接为反硝化细菌提供能量和电子，促进反硝化作用而使土壤NO-3-N浓度下降。前人报道[24]硝化抑制剂Nitrapyrin能够大幅降低硝化作用强度，但可能增加NH+4通过NH3的挥发途径损失，尤其是碱性土壤。因此，Nitrapyrin还可能增加NH+4通过NH3挥发的损失，从而减少硝化作用底物进而减少NO-3的产生[29]。同样的，MHPP作为生物硝化抑制剂不仅能降低NO-3-N的产生量，其本身67%的较高含碳量可能在培养后期NH+4浓度较低时促进反硝化作用，而导致NO-3-N消耗量增加。

3.2 硝化抑制剂对N2O产生的影响

在微生物的参与下，土壤中产生N2O的途径主要包括自养硝化、异养硝化、生物反硝化、硝化细菌反硝化、硝态氮异化还原成铵等[30]。施肥和耕作方式、水分和通气状况、有机碳和氮等众多因素都能影响N2O的产生和排放[31]。大量文献报道，在氧气充足的条件下，硝化作用是N2O产生的主要途径；在兼性厌氧条件下，硝化细菌反硝化作用的发生会增加N2O产生；在厌氧条件下，反硝化作用主导N2O的产生[32-34]。Well等[34]研究了3个不同温带土壤N2O的产生过程，发现在土壤含水量为39%～87%WFPS的壤质黏土中，土壤排放的N2O有84%～91%来自自养硝化过程。在本研究的好氧环境和水分条件下，N2O可能主要通过硝化作用产生[35]。因此，硝化抑制剂可通过抑制氨氧化微生物的活性，延缓NH+4-N向NO-3-N的转化，直接降低N2O硝化作用产生[36]。同时，硝化作用被抑制使得作为反硝化底物的NO-3产生量减少，进而影响反硝化作用产生N2O[37]。然而，本研究中硝化抑制剂未能完全抑制供试土壤N2O的排放，这可能一是由于硝化抑制剂只能抑制自养硝化作用，而不能抑制异养硝化作用，因而不能对硝化作用产生完全抑制[38]；二是N2O的产生途径，除硝化和反硝化作用外，异养硝化、硝化细菌反硝化等过程，均能产生N2O。此外，不同硝化抑制剂间抑制效果存在差异，这可能还与硝化抑制剂本身特性有关[39]。

目前，大部分硝化抑制剂主要通过抑制自养硝化过程降低土壤中NO-3的积累以及减少N2O排放[40]，对异养微生物的作用并不明显。而有研究表明，酸性土壤中异养硝化对N2O排放的贡献远高于自养硝化作用[41]，因此，这可能是本研究中硝化抑制剂对酸性紫色土中N2O产生速率的抑制效果弱于石灰性紫色土的原因。Zaman等[42]的研究报道了DCD能减少37%的N2O排放，但同时也增加了29%的NH3排放量。赵颖等[43]的研究结果表明添加所施氮量0.25%的Nitrapyrin对石灰性紫色土的N2O累积排放量抑制程度达62%，与本研究70%的抑制率接近，但Nitrapyrin同样也可能造成氨气排放[44]。本研究Nitrapyrin和MHPP对N2O产生的抑制效果高于DCD和DMPP，作为同样有较高抑制率的MHPP，其生产应用和环境风险还缺乏经验，但目前对生物硝化抑制剂的研究正不断取得进展。在不同的气候环境和土壤性质下，考虑实际条件并结合作物特征对施肥方案进行调控，硝化抑制剂才能发挥其最大的农业效益。由于本研究基于室内培养试验，因此在解释田间现象时尚存在一定局限性，将来还需进行田间试验加以验证。

4 结论

（1）4种硝化抑制剂的加入均能有效抑制两种土壤中NH+4-N向NO-3-N的转化，同时降低N2O的排放，但是不同硝化抑制剂的抑制效果存在差异。

（2）各硝化抑制剂对石灰性紫色土硝化速率的抑制效果为 MHPP（93%～193%）＞Nitrapyrin（91%～191%）＞DMPP（9%～58%）＞DCD（6%～14%），对酸性紫色土硝化速率的抑制效果为MHPP（76%～116%）＞Nitrapyrin（62%～109%）＞DCD（59%～75%）＞DMPP（26%～43%）。

（3）硝化抑制剂对石灰性紫色土和酸性紫色土N2O产生总量的抑制效果分别为46%～76%和32%～54%。

（4）相较DCD和DMPP，Nitrapyrin和MHPP两种硝化抑制剂对供试土壤硝化速率和N2O产生速率均表现出较强的抑制效果。