肉苁蓉水提液对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响*

俞立新 陈学强，2 吴群峰 董卫芹 郭松华 于 健 冯 炜 杨 雷傅一峰 李俊杰 罗 程

1 中国人民解放军第九八医院 浙江 湖州 313000

2 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

3 浙江省杭州市富阳中医骨伤医院 浙江 杭州 311400

骨质疏松症是一种以骨密度降低与骨组织微细结构破坏，骨脆性增加的一种疾病，患者可在日常生活中受轻微外力下引起骨折，是临床常见病、多发病。且这一类骨折因患者多为老年人，常合并其他疾病，且骨折多为粉碎性，稳定性差，骨折愈合迟缓或不愈合时有发生，存在较高的致残率、致死率[1]。目前有关其治疗主要是通过手术、手法整复联合抗骨质疏松治疗，缺少骨质疏松骨折患者针对性治疗药物，而中药治疗骨质疏松历史悠久，疗效肯定，许多中药被证实既可改善骨质疏松同时还可促进骨折愈合。肉苁蓉属于常用补肾阳代表药，具有补益肝肾作用。中医学认为，肾主骨，骨折治法也多不离补肾益精，现代药理学发现肉苁蓉还具有一定雌激素样作用[2]。本研究拟通过骨密度测量、Micro-CT和血清白介素-1β（IL-1β）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平观察并肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂器材：体重210～250gSPF级雌性SD大鼠52只，饲养于浙江中医药大学动物实验中心。络合碘，杭州朗索医用消毒剂有限公司，批号20160720；青霉素，华北制药股份有限公司，批号F3117217；IL-1β试剂盒（批号：20160715）、TGF-β1试剂盒（批号：20160722）；双能X线骨密度扫描仪，OSTEOCORE2；Micro-CT，Skyscan1176。

1.2 肉苁蓉水提液提取：将碾碎肉苁蓉（浙江中医药大学药厂）10倍超纯水浸泡0.5小时，煎锅煎煮1.5小时，重复提取2次，混合药液旋蒸仪浓缩至浓度1.5g/ml，存放4℃冰箱备用。

1.3 造模制备：分述如下。

1.3.1 骨质疏松模型：大鼠造模前适应性饲养1周后随机分成对照组、模型组、治疗组，分别16只、18只、18只，每组依2周、6周时间点各分成两小组，治疗组和模型组均1%戊巴比妥钠麻醉（0.4ml/100g）后备皮、消毒、铺巾、切开皮肤后摘除大鼠双侧卵巢，对照组仅切开不摘除卵巢。

1.3.2 骨折模型：骨质疏松造模后6周后准备制备骨折模型，各组大鼠麻醉后行股骨中段骨密度测定，完成后取大鼠右侧股骨中段进行备皮、消毒、铺巾、切开，行股骨中段横行骨折造模[3]，并以1mm克氏针固定，消毒缝合切口皮肤。

1.4 药物干预：造模术后行股骨X线检测，剔除模型制备失败大鼠，并在造模后肌注8万单位青霉素预防感染。术后24h治疗组开始予肉苁蓉水提物灌胃（浓度1.5g/ml，1g/kg，每日1次），对照组与模型组则予同体积生理盐水灌胃。

1.5 样本收取：干预后2周、6周后收取大鼠样本，各组大鼠1%戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血5～10ml制备血清，储存于-20℃冰箱备用。然后处死大鼠，收取股骨骨折样本，并置于10%中性甲醛固定72小时。

1.6 检测指标：分述如下。

1.6.1 骨密度：所有骨质疏松造模后大鼠，行骨折造模前均麻醉后行股骨中段骨密度测定。3组大鼠在干预2周、6周后收取样本，样本在固定72小时后再次行骨密度测定。

1.6.2 Micro-CT：样本固定72小时后进行Micro-CT扫描，以骨折端上下各200张图片作为感兴趣区域(ROI)，扫描角度 360°，电流 555uA、电压 42kV，滤光片 Al 0.2mm，分辨率8.73μm，完成后进行骨痂三维图像重建与分析。检测参数如下：骨体积分数BV/TV、骨小梁模式因子(Tb.Pf)；结构模型指数(SMI)等[4]。

1.6.3 血清IL-1β、TGF-β1测定：从-20℃冰箱解冻各组大鼠血清，分别按照IL-1β和TGF-β1试剂盒说明书逐步进行检测。

1.7 统计学方法：采用统计分析软件SPSS.19进行处理。实验数据均用以均数±标准差（±s）表示，3组大鼠骨密度、Micro-CT参数、IL-1β、TGF-β1水平均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准为P＜0.05。

2 结果

2.1 3组骨密度情况：见表1。

表1 各组大鼠股骨中段骨密度结果（±s，g/cm2）

表1 各组大鼠股骨中段骨密度结果（±s，g/cm2）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。

6w 0.34±0.02 0.21±0.01△0.27±0.02*△组别对照组模型组治疗组只数8 9 9 0w 0.34±0.02 0.23±0.03△0.22±0.02△2w 0.34±0.03 0.22±0.02△0.24±0.02*△

2.2 Micro-CT二维截面：矢状位二维截面选取各组各时间点股骨纵轴中心截面图片（见图1），水平面二维截面图则选取骨折线下第100图片进行对比（图2），从图中可见各组骨痂随时间逐渐增多，但在骨折后6周不同程度塑性；同时可见对照组骨痂体积大，6周后骨痂皮质厚实并爬过骨折线，而模型组2周时骨痂骨质较少，6周后骨痂皮质稀松，治疗组2周时骨痂体积虽不大，但骨痂中骨质较模型组多，6周后骨痂塑形较好且骨折线不明显。

图1 各组股骨中段矢状位截面

图2 各组股骨中段水平截面

2.3 Micro-CT三维重建：股骨中段骨折端骨痂三维重建见图3。从图3可见各组骨折后2周骨痂沿骨折线两端骨膜形成，但各组骨折线仍然清晰，模型组与治疗组尤为明显，而骨折6周后对照组骨痂厚实，多以板状骨小梁为主，骨折线消失，而模型组骨质稀松，骨折线较模糊，但治疗组骨痂骨质较多，骨小梁规则且厚实，骨折线不明显。

图3 骨折端ROI骨痂三维重建

2.4 Micro-CT参数指标：运用软件对骨折端骨痂进行分析[4]得到相关参数见表2。

表2 各组Micro-CT参数比较（±s）

表2 各组Micro-CT参数比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。

指标BV/TV Tb.Sp Tb.N Tb.Th SMI 6w 52.73±2.64*3.56±0.13*0.24±0.03*△0.27±0.01*△1.62±0.08*对照组（n=8）2w 30.09±2.46 3.71±0.35 0.33±0.02 0.37±0.01 1.69±0.08 6w 54.46±2.24 3.61±0.22 0.33±0.03 0.37±0.02 1.70±0.08模型组（n=8）2w 32.39±2.23△4.18±0.22△0.16±0.02△0.22±0.02△2.62±0.12△6w 38.31±1.83△4.51±0.18△0.15±0.01△0.21±0.01△2.79±0.10△治疗组（n=8）2w 36.54±2.59*3.70±0.21*0.22±0.01*△0.25±0.01*△2.29±0.19*△

2.5 血清IL-1β、TGF-β1水平：见表3。

表3 各组IL-1β、TGF-β1水平比较（±s，n=8）

表3 各组IL-1β、TGF-β1水平比较（±s，n=8）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。

组别对照组模型组治疗组6w 35.65±1.86*28.86±1.70 33.90±2.33*IL-1β 2w 319.25±13.31 333.87±10.35 309.28±6.39*6w 109.46±3.40*168.15±4.83 119.10±3.56*△TGF-β1 2w 130.98±5.87*97.28±6.21 136.96±7.43*

3 讨论

近年来，中药淫羊藿、骨碎补及复方（青娥丸、六味地黄丸等）在临床实践中被证实可明显改善骨质疏松症候[1]，这类中药及复方多以补益肝肾为主，这与骨折中后期补肾续筋原则一致[5]。肉苁蓉始载于《神农本草经》，李时珍曰：“此物补而不峻，故有从容之义”，苁蓉味甘、咸，性温，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年之功[6]。

本研究中，干预2周、6周后治疗组骨密度均高于模型组（P＜0.05），Micro-CT扫描BV/TV参数显示治疗组在干预后两个时间点结果与骨密度测定结果一致，而BV/TV是骨质疏松性骨折愈合评估的重要指标，直接反映骨痂骨质含量，这说明肉苁蓉可能具有促进成骨的作用，分析原因可能与肉苁蓉中有效成分具有上调BMP2作用有关[7]，而BMP2为TGF-β家族中成员之一。并且这一结果也被Micro-CT扫描其他参数（Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI）所印证，Tb.Sp、SMI反映的是骨痂生物力学特性，治疗组中数值明显优于模型组，这也进一步提示肉苁蓉具有改善骨量丢失，促进成骨进而加快骨折愈合的作用。

在血清IL-1β、TGF-β1水平方面，干预2周、6周后发现治疗组IL-1β水平2周时均低于其他两组，在6周时，虽然治疗组IL-1β水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；而治疗组TGF-β1水平，在2周、6周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。而IL-1β水平直接影响破骨细胞的分化与活性，其水平升高将会促进骨吸收，抑制成骨细胞增殖、分化，但TGF-β1则与骨性干细胞增殖、分化、迁移密切相关，具有促进软骨和骨痂形成[2]，加快骨痂塑形的作用，这提示肉苁蓉改善骨量丢失，促进成骨，加快骨折愈合作用可能通过降低骨质疏松性骨折大鼠IL-1β水平、抑制破骨细胞活性实现；此外可能还与肉苁蓉可升高骨折大鼠TGF-β1水平，促进成骨分化与骨痂成熟塑形有关。

综上所述，依据骨密度、Micro-CT扫描参数分析及血清IL-1β、TGF-β1水平，发现肉苁蓉水提物可改善骨丢失，促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1β分泌和促进TGF-β1分泌，进而改善骨质疏松、促进骨折愈合有关。