荜茇酰胺通过抗炎作用缓解糖尿病心肌病小鼠的心肌病变*

庄 飞， 梁 广， 钱建畅， 郑 超

(温州医科大学 1第二临床医学院， 2附属第二医院， 3药学院， 浙江 温州 325035)

糖尿病是常见的内分泌与代谢性疾病，在全国乃至全世界范围内的发病人群日益增多[1]，糖尿病所导致的各种急慢性并发症，特别是心血管并发症被认为是糖尿病患者致残和死亡的主要原因[2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)的疾病特征是糖尿病所致的心肌结构及心脏功能改变，包括心室肥厚、心肌纤维化以及心功能下降，甚至心力衰竭等[3-4]。因此寻求一种新的药物，并进一步探索有效的治疗方案，具有重要的意义。荜茇酰胺(piperlongumine，PL)是中药荜茇中提取的有效成分，具有抗炎和抗氧化等多种药理学作用[5]，目前多用于抗乳腺癌和前列腺癌等肿瘤的研究[6-8]，然而对于糖尿病并发症的涉及较少，其效果及机制并不明确。本研究通过高糖刺激的大鼠心肌 H9C2细胞模型以及链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)小鼠模型，探究PL是否能够缓解DCM的发生发展。

材 料 和 方 法

1 细胞株和动物

心肌H9C2细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所。SPF级C57BL/6小鼠，雄性，5～6周龄，20～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证编号为SCXK(浙)2015-0009。

2 主要试剂

荜茇酰胺购自瀚香生物科技公司,用0.1%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，配制成20 mmol/L的母液贮存；STZ和MTT购自Sigma-Aldrich；DMEM培养基、含EDTA的胰酶和胎牛血清购自Gibco；RIPA裂解液和HE染色试剂盒购自碧云天生物技术公司；抗转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)及Ⅳ型胶原蛋白(collagen IV)兔源性 I 抗购自Abcam；抗GAPDH兔源性 I 抗购自杭州贤至生物科技有限公司；过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自翊圣公司；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)试剂盒及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成公司；TRIzol和逆转录试剂盒购自TaKaRa。所用引物由上海吉凯基因技术有限公司根据设计合成，见表1。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1 细胞培养 H9C2细胞培养于含有10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM(含1 g/L D-glucose)的细胞培养液中，37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，隔天换液。待细胞密度生长至70%～80%即可进行实验。

3.2 MTT法检测细胞活力 将生长到指数生长期的H9C2细胞以每孔5 000个接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度梯度的PL孵育48 h。随后加入MTT，在恒温培养箱中继续孵育4～6 h，弃去培养基，加入150 μL DMSO，用酶标仪检测各孔490 nm的吸光度(A)值。细胞相对活力用与对照组细胞吸光度的比值来表示，以此计算出PL的半数抑制浓度(IC50)。

3.3 qPCR实验 用TRIzol变性破碎细胞，依次用氯仿、异丙醇以及无水乙醇分离提纯总RNA。参照二步法逆转录试剂盒操作说明书进行逆转录，获得cDNA，进行qPCR。qPCR体系为10 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各 0.25 μL，SYBR 溶液5.25 μL，超纯水3.25 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 7 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，重复 40 个循环。以β-actin 作为内参照进行结果分析，用2-ΔΔCt计算相应mRNA的相对表达量。

3.4 Western blot实验 取药物处理后细胞，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制剂及RIPA裂解液冰上裂解，收集细胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min收集蛋白，并用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。用SDS-PAGE分离不同分子量的蛋白，电转到PDVF膜上，室温下用TBST配制的脱脂牛乳封闭1.5 h。加入 I 抗4 ℃摇床孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min后室温 II 抗孵育1 h，用ECL化学发光剂在凝胶成像系统上显影。

3.5 动物实验 C57BL/6小鼠适应性饲养1周后随机分为空白对照(control)组(n=6)和T1DM组(n≥18)。T1DM组腹腔注射STZ 50 mg/kg(用柠檬酸钠缓冲液配置，pH 4.5)，每天1次,连用5 d，1周后血糖≥12 mmol/L认为造模成功。将T1DM小鼠随机分为T1DM组(n=6)、T1DM+PL (2.5 mg/kg)组(n=6)及T1DM+PL (5 mg/kg)组(n=6)。后两组的小鼠在造模成功后隔天腹腔注射相应剂量PL连续13周，control组及T1DM组不作特殊处理。每组小鼠每2周监测体重及血糖变化。第13周行超声心动图检测。

13周末，小鼠用4%水合氯醛麻醉后处理，取心脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，每组取3个组织，切成5 μm切片，用于HE染色以及天狼星红染色；取血清，按照试剂盒说明书用于检测CK-MB以及LDH血清学指标。

4 统计学处理

应用SPSS 22.0以及GraphPad Prism 7软件进行数据统计分析以及作图。所有数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PL可减轻高糖诱导的心肌H9C2细胞炎症以及纤维化

心肌H9C2细胞用不同浓度的PL作用48 h，根据MTT实验结果得出PL的半数抑制浓度为35.05 μmol/L，见图1，因此我们选取1、2.5和5 μmol/L的浓度进行下一步实验。

Figure 1. The IC50of PL for the viability of H9C2 cells.

图1 PL影响H9C2细胞生长的半数抑制浓度

1.1 PL可抑制高糖诱导的H9C2细胞炎症因子的水平 将生长至对数生长期的H9C2细胞接种于6孔板中，上述浓度PL预处理1 h后，加入终浓度为33 mmol/L的葡萄糖溶液，继续培养24 h，收集细胞提取RNA进行qPCR。结果显示高糖(high glucose,HG)组较空白组炎症因子TNF-α 和 IL-6的mRNA水平显著升高(P<0.01)，PL处理后TNF-α和IL-6的mRNA水平较HG组均有所下降，并呈剂量依赖性，见图2。在充分考虑药物毒性的前提下，为了让实验结果更加明确，在后续实验中，我们选取2.5 μmol/L和5 μmol/L 2个浓度的PL。

Figure 2. PL attenuated HG-induced cardiac inflammation in the H9C2 cells. The mRNA expression of TNF-α and IL-6 was detected by qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

图2 PL可抑制高糖诱导的H9C2细胞炎症因子的mRNA水平

1.2 PL可减轻高糖诱导的H9C2细胞纤维化 将H9C2细胞用不同浓度PL预处理后，继续培养48 h，收集蛋白。结果显示，高糖可增加纤维化标志蛋白TGF-β及collagen IV的表达(P<0.01)，PL处理后表达下降，并呈剂量依赖性(P<0.01),见图3。

Figure 3. PL alleviated HG-induced cardiac fibrosis. The protein levels of collagen IV and TGF-β were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

图3 PL可减轻高糖诱导的H9C2细胞纤维化的蛋白表达

2 PL可缓解糖尿病心肌病小鼠的心肌损伤及纤维化

PL给药过程中并不影响糖尿病小鼠的血糖,见图4。HE染色显示T1DM组心肌排列紊乱，细胞肥大，PL可逆转此变化,见图5。

Figure 4. PL didn’t change the weight and blood glucose (BG) levels in STZ-induced T1DM mice. Mean±SD.n=5.

图4 PL不改变STZ造模的1型糖尿病小鼠的血糖和体重

超声心动图提示，在造模(T1DM)组，室间隔厚度较正常(control)组增加(P<0.01)，PL给药后可以减轻室壁增厚(P<0.01)。功能性指标如射血分数(ejection fraction，EF)也反映出相同特征，T1DM组小鼠的射血分数低于control组，PL可增加糖尿病心肌病小鼠的射血分数(P<0.01)，从而改善心功能，见表2。

2.1 PL缓解糖尿病心肌病小鼠心肌损伤 心肌损伤的血清学指标如CK-MB及LDH在T1DM组小鼠中升高，然而使用PL可以使CK-MB及LDH均明显下降(P<0.01)，见图6。

2.2 PL缓解糖尿病心肌病小鼠的心肌纤维化 天狼星红染色所示，T1DM组胶原纤维较control组增多，在应用PL后，胶原纤维较造模组明显减少，见图5。

讨 论

糖尿病心肌病是指发生于糖尿病患者，不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其它心脏病变来解释的心肌疾病，包括心肌结构以及心脏功能的改变[9-10]。研究表明，多种因素参与了糖尿病心血管并发症的发生发展，如慢性炎性、氧化应激、细胞凋亡、胰岛素抵抗和内皮细胞功能失调等等[11-13]，相互交织共同作用，造成了心脏损害。炎症，特别是慢性炎症在糖尿病并发症的发生发展中发挥着重要作用。长期糖尿病导致的高糖环境可导致炎症因子如TNF-α和IL-6等在体内释放增多，反复长期慢性炎症刺激，导致心肌细胞肥大、凋亡，心肌间质纤维化等改变，可能是糖尿病心肌病结构和功能异常的主要原因[14]。

Figure 5. PL alleviated disorder of basic structure (HE staining, ×200) and cardiac fibrosis (Sirius red staining, ×200) in the diabetic cardiomyopathy mice.

图5 PL可缓解糖尿病心肌病小鼠的心肌结构紊乱及纤维化等病理变化

表2 心脏超声心动图测量数据

IVSd: diastolic interventricular septal thickness; FS: fraction shortening; EF: ejection fraction; ICT: isovolumic contraction time; Et: ejection time; IRT: isovolumic relaxation time.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT1DM group.

Figure 6. PL mitigated myocardial injury in T1DM mice. Serum CK-MB and serum LDH were examined. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsT1DM group.

图6 PL可降低血清心肌损伤指标肌酸激酶同工酶和乳酸脱氢酶水平

荜茇酰胺是从胡椒科植物荜茇的果穗中分离出的生物碱天然产物[15]，具有抑制肿瘤、抗炎和抗氧化等多种生物学活性[5]。已有研究成果表明，PL通过抑制NF-κB磷酸化从而缓解炎症反应，同时，下调MAPKs的活性可成为PL抗炎的另一可能机制[16]。本研究表明，PL可以减少高糖环境下炎症因子的表达，从而缓解高糖环境下的心肌细胞的纤维化；在STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型中，PL可降低心肌损伤指标CK-MB和LDH水平，改善心脏功能,减轻心肌纤维化。抑制炎症因子的释放，可能是PL缓解糖尿病心肌病的主要机制。

本研究证实，高糖诱导的慢性炎症可以促进糖尿病心肌病的发生发展，PL可以抑制炎症因子的释放，我们可以推测PL对糖尿病心肌病可以产生保护性作用。但本研究并未涉及更深层次的机制，具体机制有待进一步探索。

综上所述，本项研究揭示了，PL通过其抗炎作用缓解心肌纤维化和心肌损伤，从而对糖尿病心肌病小鼠的心肌产生保护性作用。因此，PL可能成为糖尿病心肌病的潜在治疗药物，抑制炎症可能成为治疗糖尿病心肌病的潜在靶点。