切值重设定在串联质谱法筛查新生儿高苯丙氨酸血症中的临床价值

吴学威，李闪闪，万志丹，李冬秀，梁 睿，钟裕恒，欧锦留，黄 湘,△

(1.南方医科大学附属中山博爱医院产期诊断中心，广东中山 528403;2.南方医科大学第二临床医学院，广东广州 510000)

高苯丙氨酸血症(HPA)是以血苯丙氨酸升高为特征的一种在新生儿中较为常见的代谢疾病，患儿常在3～6个月开始出现皮肤、毛发、体味改变及神经系统异常，但确诊和防治手段较为简单[1]，故国内新生儿筛查实验室均相继开展苯丙氨酸(Phe)及酪氨酸(Tyr)检测，协助临床医师早期发现、确诊并治疗HPA患儿，避免疾病的发展；目前，筛查HPA的检测方法多样，但传统的荧光法耗时费力，故一次实验可筛查多项指标的串联质谱技术应运而生，并迅速应用于临床；南方医科大学附属中山博爱医院新生儿疾病筛查中心自2014年在中山市率先使用串联质谱法进行新生儿代谢病的筛查以来，年筛查量递增，现考虑地域、实验室差异等因素对筛查切值的影响，为提高筛查特异度，遂系统性回顾分析本实验室串联质谱法筛查新生儿HPA的结果，包括2016年11月28日切值重设定前后的85 323例新筛数据，以全面系统地了解Phe、Phe/Tyr切值重设定的意义，明确其对临床诊治HPA患儿的指导价值，并为同行实验室相关参考值的设定提供思路和参考依据，促进新生儿疾病防治及社会健康的发展。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年4月12日至2018年9月25日于中山博爱医院行新筛的85 323例0～6个月新生儿为研究对象。其中，男占53.25%(45 433/85 323)，女占46.75%(39 890/85 323)，包括中山市17个镇区医院筛查标本。各采血机构人员均由中山博爱医院新生儿疾病筛查中心医务人员培训并审核，符合《新生儿疾病筛查技术规范》的新生儿干血斑采集规范。本研究获取中山市博爱医院伦理委员会批准后实行。

1.2仪器与试剂 泵处理器(Waters 1525u)，样本处理器(Waters 2777)，超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪(Acquity)，串联四级杆质谱检测器(TQ Detector)，数据处理工作站(Waters C20X)，数据处理软件(Waters MassLynx V4.1 SCN849)，单层孵育振荡器、移液枪(ThermoSCIENTIFIC)，打孔器(PerkinElmer)，检测试剂盒(PerkinElmer NeoBaseTMNon-derivatized MS/MS Kit)。

1.3方法 (1)采集出生0～6个月经充分哺乳的婴儿足跟血滴至滤纸卡片并于阴凉处晾干；(2)使用全自动打孔器取直径3.2 mm的圆形质控品和待测样本干血斑片，置入96孔V型截底透明微孔板中；(3)内标准品与萃取液按1∶110的比例配成工作液，每孔加入工作液100 μL后封膜，并确保密封性良好；(4)将微孔板放入45 ℃、700 r/min的恒温孵育振荡器震荡45 min，取出微孔板去封膜；(5)每孔吸取75 μL内容物转入96孔V型底、耐热微孔板的对应孔中，使用铝箔封套覆盖微孔板；(6)将微孔板静置至少2 h后装载到自动进样器中，启动检测；(7)使用数据处理工作站及软件进行数据分析和结果传输；(8)结果判读：对检测结果按照2016年11月28日切值改变前Phe:22.8～85.8 μmol/L、Phe/Tyr：0.1～1.1，切值改变后Phe:28.8～106.7 μmol/L、Phe/Tyr：0.19～1.54判定筛查结果；(9)召回筛查阳性病例，使用串联质谱、全自动荧光免疫分析仪(GSP)复查，结果均为阳性者，推荐至上级医院进行确诊分型及PAH基因检测，以鉴别PAH缺乏症和BH4缺乏症，明确PAH基因突变类型以指导生育[2-3]；(10)随访：新生儿出院15 d进行电话及短信随访，出生42 d，3、6、8、12、18、24、30、36个月返院进行常规检查。

1.4统计学处理 使用SPSS22.0软件进行数据分析，计数资料以例(n)表示，阳性率使用百分率(%)，K-S法检验数据是否为正态性分布，偏度系数、峰度系数分析偏态类型，计数资料的组间差异性比较采用χ2检验，检验水准：α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1整体资料 2016年11月28日本实验室对积累的37 527例新生儿HPA筛查指标，即Phe、Phe/Tyr，采用99%百分位数法进行切值重设定，将Phe、Phe/Tyr的切值分别由原来的22.8～85.8 μmol/L、0.1～1.1重设定为28.8～106.7 μmol/L、0.19～1.54。切值重设定后积累47 796例筛查结果；切值改变前后筛查阳性例数分别为：1 716、223例，筛查阳性率分别为4.57%、0.47%，确诊HPA分别为2、3例，且确诊的5例HPA均为苯丙酮尿症(KPU)，本市新生儿HPA发病率约为1/17 064(5/85 323)，切值设定后筛查假阳性率降低了89.92%。对积累的85 323例Phe、Phe/Tyr筛查结果用K-S检验分析，Z统计量分别为20.215、110.778，提示Phe、Phe/Tyr均为非正态分布(P=0.00)，对其进行偏度系数(S)、峰度系数(K)分析，发现Phe、Phe/Tyr筛查数据呈正偏态分布(K、S均大于0)；分析近4年多全部积累数据，以99%参考值范围(CI)表示为：Phe:29.93～106.53 μmol/L，Phe/Tyr：0.19～1.42，与现用新切值无明显差异。另外，用新切值对5例确诊的病例进行验证，发现并无漏筛。见表1。

2.2切值设定前后的数据分析 对切值改变前后的新生儿Phe、Tyr筛查结果分别用原、新Phe切值，原Phe+Phe/Tyr切值、新Phe+Phe/Tyr切值、HPA诊断“金标准”(120 μmol/L)的筛查阳性率进行分析，统计其99%参考区间并与全部新筛数据对比，结果显示新Phe、Phe/Tyr切值较原Phe、Phe/Tyr切值对新筛HPA有更低的筛查阳性率；新Phe、Phe/Tyr切值与HPA诊断“金标准”120 μmol/L的筛查情况比较时，发现Phe、Phe/Tyr联用较Phe更有助于提高HPA的筛查特异度，见表2。

2.3男女新生儿筛查结果 按性别对85 323例新生儿的Phe及Tyr筛查结果分组，对男女两组数据统计分析用Phe原、新切值，Phe联合Phe/Tyr原、现切值，HPA诊断“金标准”(120 μmol/L)的筛查阳性率及99%参考值范围，并与全部新筛数据对比，发现无论采用何种切值分析男女新生儿的Phe、Phe/Tyr数据，其筛查阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)，表明新生儿性别差异对Phe、Phe/Tyr切值的影响差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 切值重设定前后具体情况

注：-表示无数据

表2 切值改变前后筛查结果分析

表3 男女新生儿筛查结果分析

3 讨 论

新生儿进行HPA筛查是非常有必要的。大规模数据分析曾报道我国HPA发病率为1/6 984[4]，但由于人口基数大，我国新生儿发病人数较多，患儿可有智力落后等严重症状，依赖血Phe水平、Phe/Tyr比值，结合临床医师的诊疗经验，能早期发现并确诊新生儿HPA，积极采取低苯丙氨酸饮食进行预防和治疗，即可避免HPA患儿智力发育障碍[1]。本研究分析发现本市新生儿HPA发病率约为1/17 064，对比国内既往文献报道，本市新生儿HPA发病率低于全国平均水平，且我国南方地区发病率普遍低于北方，分析可能为南北差异和地域因素导致[5-11]；本实验室在开展新生儿疾病筛查项目以来，重视新生儿HPA的筛查，本着为临床服务的原则不断改进，现系统分析积累的新生儿Phe、Phe/Tyr筛查数据，以更好地总结本市新筛特点和优势，更好地服务于临床，提高人口素质。

根据本地区筛查数据进行切值重设定可获得更高的筛查特异度。2016年11月28日设定本实验室参考值前，本实验室使用厂家提供切值进行串联质谱法筛查新生儿HPA；但临床实践发现，Phe采用85.8 μmol/L的切值上限在中山地区有较高的筛查阳性率(4.57%)，明显高于全国既往报道的发病率，且临床召回后发现筛查假阳性率较高；故在积累本实验室37 527例筛查结果的基础上，对数据进行重新分析，发现采用99%百分位数法重设定切值时，即Phe：28.8～106.7 μmol/L、Phe/Tyr：0.19～1.54，筛查灵敏度、特异度均较高，此后本实验室采用新切值进行新生儿HPA的筛查；对本实验室目前已积累85 323例数据进行系统分析，发现筛查假阳性率降低了89.92%，结合新切值无漏筛确诊病例及在定期随访和返院常规检查中未发现假阴性案例，表明新切值明显提高了筛查特异性；同时，对切值重设定后的筛查数据用原切值分析发现筛查阳性率为3.28%，明显高于切值重设定后的筛查阳性率0.47%，这反映了新切值在降低假阳性率、减轻临床工作量、减少家庭和社会负担方面有重要的价值。

确定召回筛查阳性病例标准及进行阴性随访的必要性。实验室对筛查阳性的判定标准为：Phe和(或)Phe/Tyr高于切值上限，但临床对筛查阳性进行召回的标准往往以Phe>120 μmol/L为主，兼顾Phe/Tyr比值及临床表现等，这就导致临床和实验室、各医院甚至同一医院不同医生对筛查阳性召回标准不同；考虑既往HPA的诊断标准为持续性Phe高于120 μmol/L，本研究对各分组数据进行Phe为120 μmol/L切值的分析，发现仅以Phe初筛为120 μmol/L进行召回较Phe联合Phe/Tyr有较高的筛查阳性率(P=0.00)，且筛查阳性率明显高于报道发病率，目前国内外有文献及共识建议以血Phe浓度>120 μmol/L(>2 mg/dL)及血Phe与Tyr比值(Phe/Tyr)>2.0诊断HPA[12,16]，结合本研究中发现Phe联合Phe/Tyr进行筛查能提高筛查特异度，呼吁临床在进行病例召回时重视Phe/Tyr因素，召回后使用另一种检测方法进行验证，尊重经验丰富的临床医生的诊断意见，提高新生儿HPA的确诊和防治水平。另外，本回顾性分析中严格按照儿童管理规范要求对0～36个月参加新生儿筛查的婴幼儿进行定期电话随访及返院检查，暂未发现假阴性案例，表明本实验室切值重设定确实提高了筛查特异度，但因3个月后婴幼儿返院检查依从性较低，存在随访丢失、阴性随访率低及随访时间较短的问题，故如何进行高效率的阴性病例随访仍是一个亟待解决的问题。

男女性别对Phe、Phe/Tyr切值无明显影响。根据目前资料分析，不排除新生儿性别、出生孕周、体质量对新生儿血Phe、Tyr水平存在影响，但各实验室针对新生儿男女性别、出生孕周、体质量等对HPA筛查的影响方面缺乏研究；本研究现对男女新生儿Phe、Phe/Tyr筛查数据进行多种水平的切值探讨、分析，发现男女新生儿的相关筛查阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)，表明了性别因素对新生儿HPA筛查不存在明显影响，在新生儿HPA筛查时无须按照性别差异对Phe、Phe/Tyr进行切值设定；但本实验室未整理新生儿出生孕周、体质量的相关数据，现缺乏相关分析和结论，值得进一步总结探讨。

本研究切值设定方法的局限性。统计学认为采用ROC曲线法设定切值更合理，且本实验室积累Phe、Phe/Tyr浓度数据不服从正态分布，提示使用百分位数法进行切值重设定存在一定的不合理性；但本实验室确诊病例较少，不足以进行ROC曲线分析法设定切值；考虑到实验室积累的总筛查数量较大，采用99%百分位数进行切值重设定，明显降低了本实验室的筛查假阳性率，但筛查阳性率仍明显高于本市HPA约1/17 064的发病率及大规模数据分析报道HPA的1/6 984发病率，表明本实验室可能存在筛查假阳性率较高的问题，但考虑需保证筛查的灵敏度，未进一步设定更高水平的切值上限。同时，进行Phe切值对比发现，本实验室新切值与陕西宝鸡市相近[13]，但与以120 μmol/L为参考切值上限的实验室切值有较大差异[14-15]，故本实验室有必要在积累足够的阳性病例后对HPA筛查数据采用ROC曲线法进行Phe及Phe/Tyr切值的重设定，并合理地进行阴性随访，以进一步提高筛查特异度，促进医疗事业的发展。

4 结 论

切值重设定在串联质谱法行新生儿HPA筛查中具有较高的临床价值和社会、经济效益，能显著提高筛查特异度，降低假阳性率，协助临床早期确诊HPA患儿，及早采取饮食控制及个性化治疗手段进行干预，可避免患儿的神经系统损害，减少家庭压力及社会负担[3，16-17]。