沙门氏菌菌蜕佐剂增强结核分枝杆菌4种蛋白的免疫作用研究

李 鹤，党光辉，于申业，程玉笛，刘虹秀，宋宁宁，陈利苹，刘思国

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/ 动物细菌病创新团队，黑龙江哈尔滨150069)

结核病(TB)每年感染约一千万人并造成近140万患者死亡，同时也是艾滋病病人在免疫力低下时主要的感染源，可以引发细菌病毒混合感染造成患者死亡[1]。近年来，不合理用药导致了多重耐药结核(MDR-TB)和广谱耐药结核(XDR-TB)的出现，更加重了公共卫生安全隐患。卡介苗(Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是目前唯一可以用于人TB 预防的商品化疫苗，但0～80 %的不稳定保护率使其对疾病的防控存在一定风险[2]，因此新型疫苗成为该病疫苗领域的重点研发对象，如含有Ag85A 的重组活载体疫苗、DNA 疫苗等[3]。考虑到活苗存在毒力返强、成本过高以及不适用于免疫缺陷病人等缺点，只含有保护性抗原的基因工程亚单位疫苗因不具有感染性风险便应运而生。较为成功的亚单位疫苗如ESAT-6/Ag85B，Mtb32/Mtb39基因融合亚单位疫苗目前也即将进入一期临床试验阶段[4]。但单一的基因重组亚单位疫苗在无佐剂的情况下免疫原性不高[5]，因此本研究采用小鼠模型评价菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4 种抗原的免疫增强作用并与弗氏不完全佐剂(IFA)进行比较，为新型抗TB 亚单位疫苗的研制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 110 只6 周龄～7 周龄SPF 级雌性BALB/c 小鼠，购自北京维通利华有限公司。Rv3802c、 Rv0394c (SEC)、 Rv0199 和 E6c10 4 种MTB 蛋白(1 mg/mL)，肠炎沙门氏菌DH091 菌蜕产物(108cfu /mL)，均由本实验室制备保存。IFA 购自Sigma 公司；96 孔酶标板购自Costar 公司；CBS(碳酸盐缓冲液)干粉购自北京索莱宝科技有限公司；山羊抗小鼠HRP-IgG 购自Sigma 公司；用于检测IgG1和IgG2a 亚型的包被抗原及HRP 标记山羊抗小鼠IgG (IgG-HRP)抗体购自SouthernBiotech 公司；小鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒购自天津灏阳生物科技有限公司；APC 标记的抗CD3 抗体、FITC 标记的抗CD4 抗体、PE 标记的抗CD8 抗体均购自Invitrogen公司；IFN-γ 和IL-4 检测试剂盒购自武汉优尔生生物技术有限公司。

1.2 小鼠免疫实验设计 实验分11 组，每组10 只小鼠，小鼠的免疫实验设计见表1，各免疫小组以沙门氏菌菌蜕佐剂(108cfu/mL)分别与上述4 种可溶性蛋白(1 mg/mL)按照体积比 1∶1 混匀后 200 μL/ 只背部皮下肌肉注射免疫小鼠；IFA 与上述4 种蛋白分别混合乳化，使每组中蛋白含量也为100 μg，同样剂量同样方式免疫小鼠。以PBS 组、IFA 组、ghost 组作为阴性对照，上述11 组小鼠免疫3 次，每次间隔2 周。分别于一免14 d (2 周)及二免14 d(2 周)小鼠尾静脉采血，分离血清，用于检测小鼠体内血清特异性抗体。三免后每周(7 d)采血分离血清，持续到3 免后的第9 周(63 d)，分离的血清用于检测抗体的持续期。

表1 小鼠免疫实验设计Table 1 The immunization mice groups and dose of the vaccines

1.3 ELISA 检测免疫小鼠血清抗体及抗体亚类 以100 μL CBS 含有 0.5 μg 的 Rv3802c、Rv0394c(SEC)、Rv0199、E6c10 溶液为包被抗原包被ELISA 板，以不同时间点采集的免疫后小鼠血清(1∶200)为一抗，山 羊 抗 小 鼠 IgG-HRP 作 为 二 抗 (1 ∶5 000)， 采 用ELISA 方法检测小鼠血清抗体。同时以三免后的第一周为起点，持续检测免疫小鼠抗体动态变化至三免后的第9 周。参照IgG1 与IgG2a 检测试剂盒操作说明检测一免后2 周(14 d)及二免后2 周(14 d)小鼠血清中不同的免疫球蛋白亚类IgG1 与IgG2a。

1.4 小鼠脾淋巴细胞分泌的细胞因子及其T 细胞亚类的检测 分别于一免14 d 及二免14 d 时每组随机迫杀3 只小鼠，采集其脾脏，参照试剂盒说明书分离小鼠脾脏淋巴细胞，将分离的小鼠脾脏淋巴细胞用PBS 清洗3 次，重悬于含有10 %的胎牛血清及1 %双抗的RPMI-1640 培养基中，置于六孔板中培养，每孔约含有1.6×108个细胞，对应于相应的蛋白免疫组，每孔分别加入 5 μg Rv3802c、Rv0394c(SEC)、Rv0199、E6c10 蛋白刺激后，于37 ℃，5 % CO2培养24 h，回收细胞培养上清，按1∶200 的比例进行稀释，参照IFN-γ 和IL-4 检测试剂盒说明书检测IFN-γ 和IL-4 的分泌量；同时利用流式细胞仪检测体外刺激后小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+及CD8+T 淋巴细胞的含量，实验数据用FlowJo software 进行分析。

1.5 小鼠的组织病理学观察 在二免14 d 时，将不同免疫组的小鼠随机迫杀，每组3 只，取小鼠的肝脏、脾脏样品，制作病理学切片，分别对其进行组织病理学观察。

2 结 果

2.1 小鼠血清特异性抗体的检测 一免14 d 后，采集免疫小鼠尾静脉血分离血清后进行抗体检测，结果显示，Rv0394c (SEC)+ghost 组的血清抗体水平高于 Rv0394c (SEC)+IFA 组，Rv0199+ghost 组血清抗体水平也高于Rv0199+IFA 组(p＜0.05)。小分子蛋白E6c10 的所有免疫组小鼠产生的血清抗体水平虽然比较低，但E6c10+ghost 组仍高于E6c10+IFA 组(p＜0.05)，而Rv3802c+IFA 组的血清抗体水平则高于Rv3802c+ghost 组(p＜0.05) (图1A)。二免 14 d 后检测结果显示，Rv0394c (SEC)+ghost 组、Rv0199+ghost组 、 Rv3802+ghost 组 、 Rv0394c (SEC)+IFA 组 、Rv0199+IFA 组、Rv3802+IFA 组均能够较好的刺激小鼠产生抗4 种蛋白的特异性抗体。与E6c10+IFA组相比较，E6c10+ghost 组产生了更高的抗E6c10 蛋白抗体(p＜0.001)，PBS、ghost、IFA 免疫组与一免14 d 抗体水平相比，差异不显著(图1B)。表明菌蜕佐剂与上述4 种重组蛋白免疫的均能够诱导小鼠产生高水平的血清抗体，其免疫增强效果优于IFA。

2.2 小鼠血清抗体的动态变化 持续检测3 免后9周内小鼠体内针对相应免疫蛋白的抗体水平。配伍SEC 蛋白，ghost 组和IFA 组均具有较好的免疫增强效果(图2A)，但差异不显著。对于Rv0199 蛋白，在免疫后的第6 周，Rv0199+ghost 组的免疫增强效果高于 Rv0199+IFA 组(p＜0.05)。在第 7～9 周，要极显著高于 Rv0199+IFA 组(p＜0.001)(图2B)。Rv3802c蛋白在免疫后的第6 周和第7 周时，Rv3802c+IFA组的效果显著优于Rv3802c+ghost 组(p＜0.05)，而第8 周和第 9 周时，配伍 ghost 组优于配伍 IFA 组(p＜0.05) (图2C)。而 E6c10 小分子蛋白，ghost 组的免疫增强作用始终极显著优于IFA 组(p＜0.001) (图2D)，结果表明菌蜕佐剂可以较好的增强免疫小鼠机体对上述4 种蛋白的免疫反应，且抗体的持续期较长。

图1 一免14 d (A)与二免14 d (B)小鼠血清特异性抗体检测Fig.1 Detection of specific antibody in serum of mice on the 14th day of first (A) and second immunization (B)

2.3 小鼠免疫球蛋白亚类的检测 采用IgG1 与IgG2 抗原包被ELISA 板，检测免疫后小鼠血清中免疫球蛋白亚型，并计算一免14 d 与二免14 d IgG1与 IgG2a 的比值(图 3)。相关研究表明，抗体中IgG1 与IgG2a 的比率能够部分的反映出抗原特异性T 辅淋巴细胞应答的类型，即IgG1/IgG2a＞1 时，则趋向于Th2 型免疫反应；当IgG1/IgG2a＜1 时，则趋向于Th1 型免疫反应[6]。结果表明上述免疫组小鼠体内产生的免疫反应趋向于Th2 型，Th2 型免疫反应不仅可以诱导高水平的抗原特异性抗体产生，同时其分泌的细胞因子能够增强免疫细胞对病原菌的杀伤。

2.4 流式细胞术检测免疫小鼠血清CD4+和CD8+T 细胞亚类 4 种蛋白体外刺激小鼠脾细胞，利用流式细胞仪对各组小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+T 和CD8+T 细胞含量进行检测并计算二者比值。结果显示各组小鼠CD8+T/CD4+T 分别为48.6 %，37.2 %，46.3 %，38.1 %，52.4 %，32.7 %，55.0 %，37.8 %，29.3 % (图4)，菌蜕佐剂与4 种重组蛋白免疫组的CD8+/CD4+比值数高于IFA 与4 种蛋白免疫组，且差异显著(p＜0.05，p＜0.01)。表明免疫后小鼠的淋巴细胞分化趋向于CD4+T 细胞亚类。

图2 血清抗体的动态变化Fig.2 The dynamic changes of specific antibodies in the serum

图3 一免14 d (A)及二免14 d (B)时小鼠血清中抗体亚型IgG1与IgG2a 的比值Fig.3 The ratio of antibody subtype IgG1/IgG2a in the serum of immunized mice on the 14th day of first (A)and second immunization (B)

图4 流式细胞术检测CD4+和CD8+ T 细胞的比例Fig.4 The proportion of CD4+ and CD8+ T cells detection by Flow cytometry

2.5 小鼠脾脏淋巴细胞分泌细胞因子检测 分别于一免14 d 及二免14 d 时分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，体外培养后检测细胞因子的分泌情况。IFN-γ的检测结果表明，当配伍SEC、Rv0199、E6c10 蛋白时两种佐剂的免疫增强效果相差不大，而菌蜕佐剂配伍Rv3802c 蛋白则具有较好的免疫增强作用(p＜0.05) (图5A)。IL-4 的检测结果表明与一免14 d的检测结果相比较，两种佐剂均能够较好的刺激IL-4 的分泌，导致在二免后第14 d，IL-4 细胞因子水平上升，这一结果在Rv0199 蛋白免疫组尤为明显(p＜0.01) (图5B)。细胞因子检测的结果表明，菌蜕佐剂与4 种蛋白共同免疫小鼠后，小鼠体内免疫反应趋向于Th2 型免疫应答。

2.6 免疫小鼠的病理组织学评价 为评价菌蜕佐剂与4 种蛋白共同免疫小鼠的安全性，分别对二免14 d时免疫小鼠的各个脏器进行病理组织学观察。肝脏的病理组织学检测结果显示SEC+IFA 组、ghost+SEC 蛋白组均有肝细胞变性，但病理切片显示ghost+SEC 组的肝细胞病变较轻。Rv0199+ghost 组、Rv3802+ghost 组、E6c10+ghost 免疫小鼠的肝脏无明显的病理变化，而Rv0199+IFA 组、Rv3802+IFA 组免疫小鼠的肝脏细胞出现了坏死(图6)。表明沙门氏菌菌蜕佐剂(ghost)对于免疫小鼠肝脏的安全性高于IFA。脾脏病理检测结果显示，Rv3802+IFA 组以及Rv3802+ghost 组免疫后的小鼠脾脏均存在少量的病变细胞，但E6c10+ghost 组、Rv0199+ghost 组以及ghost 免疫组也观察到了脾脏细胞的病变(图6)。表明IFA 分别与MTB 4 种重组蛋白共同免疫小鼠后，对于免疫小鼠脾脏的安全性好于沙门氏菌菌蜕佐剂。由于实验用到的小鼠，在免疫过程中及免疫后均未发生死亡，并且剖检时小鼠的脏器也未出现肉眼可见病理变化，相比于商品化的IFA，提示菌蜕佐剂可以作为良好的MTB 亚单位疫苗免疫增强剂。

图5 一免 14 d 与二免 14 d IFN-γ (A)和 IL-4 (B)免疫小鼠细胞因子的检测Fig.5 The detection of IFN-γ (A) and IL-4 (B) levels on the 14th day of first and second immunization

3 讨 论

MTB 4 种抗原 Rv3802c、Rv0394c(SEC)、Rv0199及 E6c10 (ESAT6 与 CFP10 融合蛋白)均为 MTB 中重要的毒力因子[7]，具有制备亚单位疫苗的潜质和开发前景[8]。单一的亚单位疫苗刺激免疫动物体产生的免疫反应不够，需加入佐剂免疫才能发挥疫苗效果。

图6 免疫后小鼠肝脏及脾脏病理组织学观察Fig.6 The histopathologcal examinations of the liver and spleen tissue samples from the immunized mice

细菌菌蜕是利用噬菌体PhiX174 基因对菌体打孔，从而将细菌内的核酸、蛋白等排出体外而保留了菌体表面天然结构，既能够刺激机体产生良好的细胞及体液免疫反应，又不含有致病因子，为一种良好的佐剂[9]。本研究利用上述4 种蛋白与沙门氏菌菌蜕佐剂混合后免疫小鼠，评价小鼠免疫后的各项免疫指标，结果表明菌蜕佐剂具有良好的免疫增强效果，除了对Rv3194(SEC)、Rv0199、Rv3802 等3 种大分子蛋白诱导产生与IFA 相同的免疫效果外，尤其对E6c10 小分子蛋白，其仍然能够刺激小鼠产生持续的、高水平的特异性抗体，这是IFA 所不具备的。之前的研究报道证实，亚单位疫苗在免疫小鼠后，体内产生的抗体中IgG1 与IgG2a 比率能够部分的反映出小鼠体内免疫反应的趋势[6]，本研究中小鼠体内免疫反应趋向于Th2 型免疫反应，该种免疫反应可以诱导小鼠体内产生高水平的抗原特异性抗体，同时诱导产生较高水平的Th2 型免疫反应的细胞因子 IL-4，致力于病原菌的杀伤。IFN-γ 和IL-4 是细胞免疫及体液免疫的重要分子，即分别为Th1 型细胞免疫和Th2 型细胞免疫反应的重要细胞因子，菌蜕佐剂分别与4 种蛋白混合免疫均能够较好的刺激脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ 和IL-4，虽然菌蜕佐剂与上述4 种蛋白刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力与IFA 和蛋白共同免疫组差别不大，但菌蜕佐剂刺激IL-4 的分泌效果好于IFA，表明其免疫反应趋向于Th2 型免疫应答。同时，菌蜕佐剂分别与4 种亚单位疫苗共同免疫后刺激小鼠产生CD4+T 细胞数量较多，诱导B 细胞分化成为浆细胞使机体产生大量的抗原特异性抗体[10]。

综上所述，对于3 种大分子蛋白Rv3194(SEC)、Rv0199、Rv3802，菌蜕佐剂达到了 IFA 的免疫效果，尤其对小分子蛋白E6c10 免疫增强效果更佳，同时在制备工艺上省去了乳化这一繁琐的步骤，因而具有广阔的应用前景。