多穗石柯叶水提物及其主要成分对PC12细胞增殖的影响

吕 纯，高健美，邓 艳，龚其海

(1.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099)

神经退行性疾病是一类严重影响患者身体健康及生活质量，并给其家庭及社会带来严重负担的疾病，其主要病理特征为大脑神经元及其髓鞘的退化与缺失[1]。临床实践证明，现有的药物如阿尔兹海默症治疗药多奈哌齐、美金刚，帕金森病治疗药左旋多巴、司来吉兰等均只能部分地控制症状或延缓病程[2-3]，而且由于其毒性反应较大、价格较昂贵等缺点限制了其在临床的应用。有研究报道，神经干细胞移植可有效治疗神经组织损伤[4-5]，但是由于神经干细胞获取的伦理、宗教问题[6]、体内致瘤性[7]、长期存活率及表型稳定性不理想、纯化困难等原因使其在临床中的应用受到限制。因此，探索神经退行性疾病的新疗法和替代疗法有着重要的社会意义及广阔的临床应用前景。

我国中药资源丰富，中医理法方药理论齐备，近年多项研究证明中药复方、提取物或单体具有良好的保护中枢神经系统的作用。多穗石柯[Lithocarpuspolystachys( Wall．) Rehd]又名甜茶或多穗柯，为贵州省民族药，系壳斗科石柯属常绿乔木，具有“养阴补肾、护肝解毒、清热利湿”等功效[8]。现代研究表明，多穗石柯的主要化学成分包括黄酮类、三萜类等，同时还包含多酚类、氨基酸、微量元素等[9]，可降血糖降血脂[10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、改善记忆力[13]等。本课题组前期研究表明，多穗石柯叶水提物的主要成分为根皮苷(0.64%)、三叶苷(18.54%)及茶多酚(27.65%)[14]，但是否具有促进神经细胞增殖的作用尚未见报道。基于以上背景，本研究旨在探索多穗石柯水提物及其主要成分对PC12细胞的增殖作用，并为探索神经退行性疾病的治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器 多穗石柯叶采自贵州省凤冈县，由遵义医科大学生药学教研室杨建文教授鉴定确属壳斗科石柯属植物多穗石柯的干燥叶；根皮苷标准品及三叶苷标准品购自成都普思生物科技股份有限公司；茶多酚标准品购自上海源叶生物科技有限公司。高分化大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购自美国ATCC细胞库；DMEM(高糖)培养基、磷酸盐缓冲液、青链霉素混合液及胰蛋白酶血清购自HyClone公司；澳洲胎牛血清购自Gibco公司；BrdU ELISA 试剂盒购自上海江莱实业股份有限公司。Midi40二氧化碳培养箱及全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；超净工作台(SW-CJ-IFD,泰斯特仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 多穗石柯叶水提物的制备 取30.0 g多穗石柯干燥叶于圆底烧瓶中，按1∶20的料液比加入纯净水，加热回流30 min后滤过，滤渣重复提取2次后合并滤液。将提取液减压浓缩为浸膏，放入真空冷冻干燥机干燥[14]。

1.2.2 PC12细胞的培养 按常规方法，以含10%胎牛血清、1% 青链霉素混合液的DMEM(高糖)培养基为完全培养基，在5% CO2、37℃的环境中培养PC12细胞[15]。待细胞密度达到75%～90%时用磷酸盐缓冲液洗去培养基后用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.3 PC12细胞增殖能力检测 当PC12细胞进入对数生长期后，将细胞按1×104、100 μL的浓度接种于96孔板中，培养24 h后弃培养基，根据预实验结果，分别加入不同浓度的多穗石柯水提物(0、25、50、75、100、200 μg/L)、根皮苷试剂(0、25、50、75、100、200 μM)、三叶苷试剂(0、25、50、75、100、200 μM)及茶多酚试剂(0、25、50、75、100、200 μM)。各浓度设6个复孔，置于5%CO2、37℃培养72 h后，按BrdU ELISA试剂盒说明书所述方法操作。

2 结果

2.1 多穗石柯叶水提物对PC12细胞增殖的作用 实验结果表明，25 μg/L和50 μg/L的多穗石柯水提物作用时间为72 h后,PC12细胞的BrdU相对含量(100.43±1.69%，100.66±1.60%)与对照组(100.00±1.79%)比较无统计学意义(P>0.05)。而75 μg/L、100 μg/L和200 μg/L多穗石柯叶水提物较对照组明显增加PC12细胞BrdU相对含量(120.82±1.19%，162.54±2.51%，168.54±1.33%)[F(5,30)= 199.618，P<0.001](P<0.05)(见图1)。

**:与对照组比较,P<0.01。 图1 多穗石柯叶水提物对PC12细胞增殖的作用

2.2 根皮苷对PC12细胞增殖的作用 根皮苷(0、25、50、75、100、200 μM)作用于PC12细胞72 h后，BrdU的相对含量为100.00±1.79%、100.13±1.48%、100.01±1.67%、100.31±1.00%、100.16±1.58%、100.10±1.38%，与对照组比较均无统计学意义(P>0.05，见图2)。

**:与对照组比较,P<0.01。 图2 根皮苷对PC12细胞增殖的作用

2.3 三叶苷对PC12细胞增殖的作用 实验结果显示，25、50 μM三叶苷作用72 h后，PC12细胞的BrdU相对含量(100.25±2.09%，100.11±1.80%)与对照组(100.00±1.79%)相比无统计学意义(P>0.05)。而75、100、200 μM的三叶苷作用72 h后，BrdU的相对含量分别为112.66±1.75%、143.04±2.45%及149.83±1.72%，与对照组相比具有统计学意义[F(5,30)= 93.996，P<0.001](P<0.05，见图3)。

**:与对照组比较,P<0.01。图3 三叶苷对PC12细胞增殖的作用

2.4 茶多酚对PC12细胞增殖的作用 不同浓度的茶多酚(25、50、75、100、200 μM)作用72 h后，PC12细胞BrdU的相对含量(100.34±1.71%、99.99±1.50%、100.07±1.73%、100.77±1.79%、100.35±1.78%)与对照组(100.00±1.79%)比较无统计学意义(P>0.05，见图4)。

图4 茶多酚对PC12细胞增殖的作用

3 讨论

随着我国人口老龄化日益严重，神经退行性疾病的发病率呈逐年上升趋势，寻找有益于神经系统功能维持的化合物意义重大。多穗石柯叶是一种我国使用悠久、药食同源的植物，常以“甜茶”、“甘茶”等形式出现在老百姓的生活中，因此本实验采用多穗石柯叶水提物为研究对象。高分化大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，来源于大鼠肾上腺髓质肿瘤克隆细胞系，因其具有交感神经元特性，现已广泛用于神经系统的体外研究[10-11,15-19]。BrdU是一种人工合成的胸腺嘧啶类似物，可在合成期渗入DNA分子中，在细胞培养时加入BrdU,再与BrdU单克隆抗体相结合，可反映细胞的增殖情况。因此，本研究采用BrdU ELISA法观察多穗石柯叶水提物及其主要成分 对PC12细胞增殖的影响。本研究结果表明，多穗石柯叶水提物可以明显促进PC12细胞的增殖，其主要成分三叶苷同样有显著的促PC12细胞增殖作用，而根皮苷和茶多酚对PC12细胞增殖作用无影响。提示多穗石柯水提物中的三叶苷可能是其促增殖作用的主要成分，这与本课题组的前期研究结论一致[18]。值得注意的是，三叶苷作用的PC12细胞的BrdU相对含量低于多穗石柯水提物作用的PC12细胞的BrdU相对含量，表明三叶苷的促增殖作用低于多穗石柯叶水提物。推测其原因可能于多穗石柯中含有多种化学成分，还有其他成分发挥促增殖的作用，或者由于各成分间的相互作用使其促增殖作用明显增加有关，但是具体原因及其可能的作用机制尚需进一步研究探索。

综上所述，在本实验条件下，多穗石柯叶水提物的促增殖作用可能与其主要成分三叶苷有关。但本研究初步探索了多穗石柯水提物、根皮苷、三叶苷和茶多酚对PC12细胞增殖的影响，并未对其作用机制进行分析。因此，在未来的研究中将进一步采用多种实验法，例如EDU荧光染色、流式细胞术、Western blot法等进一步验证多穗石柯水提物及其主要活性成分对PC12细胞的影响及其作用机制。本研究可为多穗石柯防治神经退行性疾病以及脑损伤的研究提供基础药理学依据。