补肾填精法对化疗源性卵巢早衰大鼠生育力保存的影响

郭淑敏， 彭慧娟， 周秀丽， 朱玲

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510120；3.广州中医药大学第一附属医院妇产科，广东广州 510405）

肿瘤及自身免疫性疾病发病率正逐年上升，化疗药是治疗此类疾病的重要药物。部分化疗药物的性腺毒性已经得到临床及实验证实，其中卵巢毒性风险系数最高的是烷化剂，以环磷酰胺（CTX）为代表性药物。化疗药物治疗原发病的同时导致年轻女性患者卵巢功能损伤甚至出现卵巢早衰[1]（premature ovarian failure，POF）的副作用日渐凸显，增加了不孕不育的风险，严重影响女性患者的生育健康。化疗源性POF的发病机理及治疗药物的临床疗效评价已成为研究热点。POF西医治疗方法包括雌孕激素替代治疗、促排卵、赠卵、卵巢冷冻移植等，手段局限，历时长，效果不甚理想。而中医药因治疗POF方法简便、疗效可靠而被广泛运用于临床，值得深入研究。明代张景岳创立的补肾填精法代表方左归丸体现了“阳中求阴”的制方特点，有滋肾阴，养精血，兼具活血之功，临床用于治疗POF取得一定的疗效[2]。本研究通过腹腔注射CTX建立化疗源性POF大鼠模型，观察左归丸干预后对化疗源性POF大鼠受孕能力的影响，以期为临床保存化疗源性POF患者生育力治疗提供参考，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择9周龄SPF级雌性SD大鼠121只，雄性SD大鼠20只，平均体质量180～220 g。由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号：44007200026331。实验前行阴道涂片，有正常动情周期的雌鼠纳入实验。

1.2 实验药物、试剂与仪器 左归丸，每瓶45 g，河南宛西制药，生产批号：150211，国药准字Z41020696）；注射用醋酸曲普瑞林[gonadotropinreleasing hormone（GnRH），商品名：达菲林]，每瓶3.75 mg，法国益普生生物制药公司生产，产品批号：H16290，进口药品注册证号：H20140298。CTX，每片0.2 g，由山西普德药业股份有限公司生产，生产批号：04150403，国药准字H14023686；（9.0 g/L）氯化钠注射液（生理盐水），每瓶100 mL规格，四川科伦药业股份有限公司生产，批号：C17093103-2，国药准字H51021156。IX71倒置荧光显微镜，购自日本Olympus公司。

1.3 左归丸剂量 按大鼠与人用药剂量换算公式[3]，已知A组成人每60 kg体质量用药量，欲估算B种动物每kg体质量用药剂量，B鼠（g·kg-1）=6.25 ×A人（g·kg-1）≈ 1.875 g·kg-1，人剂量为18 g/60 kg，大鼠平均体质量为250 g。计算所得大鼠左归丸给药剂量为1.6 g·kg-1·d-1（设为中剂量），以此设定低剂量为0.8 g·kg-1·d-1、高剂量为3.2 g·kg-1·d-1。制粉剂后，分别以过滤水配制灌胃质量浓度：低剂量为0.1 g/mL、中剂量为0.2 g/mL、高剂量为0.4 g/mL。

1.4 分组 将实验入组动物（121只）按随机数字表随机分为空白组，模型组，POF左归丸低、中、高剂量组，POF达菲林组，非POF左归丸组，非POF达菲林组等8组。

1.5 造模与给药

1.5.1 造模前给药 POF达菲林组、非POF达菲林组需造模前给药。达菲林配制浓度为0.75 g/L。从造模前第10天当天，POF达菲林组、非POF达菲林组每只大鼠给予肌肉注射0.5 mL达菲林药液（释放量为12.5 μg/d），仅1次（10 d后卵巢功能受抑制，处于动情间期）。其他各组同时给予肌肉注射0.5 mL 9.0 g/L生理盐水，仅1次。

1.5.2 造模 模型组，POF左归丸低、中、高剂量组，POF达菲林组，参考文献[4，5]建立化疗源性POF大鼠模型。经反复预实验摸索，拟定既导致POF而动物死亡率又最低的最小化疗剂量：第1天给予腹腔注射CTX负荷剂量50.0 mg/kg，后以5.0 mg/kg的维持剂量连续注射14 d，每日1次。而空白组、非POF左归丸组及非POF达菲林组大鼠在造模期间仅以9.0 g/L生理盐水2 mL连续腹腔注射15 d，每日1次。

1.5.3 造模后给药 造模结束后，空白组、模型组给予过滤水灌胃，POF左归丸低、中、高剂量组给予左归丸药液灌胃，POF达菲林组给予过滤水灌胃，非POF左归丸组给予左归丸药液灌胃，非POF达菲林组给予过滤水灌胃，每次2 mL，连续灌胃60 d，每日1次。

1.6 观察指标与方法 分别于灌胃30、60 d后，每组取半数雌鼠以雌∶雄=2∶1比例合笼交配，次日早晨肉眼观察雌鼠阴道，取阴道涂片进行检测。以肉眼发现阴栓，阴道涂片显微镜下发现精子为受孕标志，当日作为“受孕日”。持续合笼15 d，如检测到阴栓及精子则停止试孕，单独放置。合笼15 d结束后，解剖大鼠，裸眼观察子宫情况，统计胚胎着床情况，计算受孕率。

1.7 统计方法 采用STATA.12统计软件进行数据分析，计数资料采用卡方检验。当n≥40且所有T≥5时，用卡方检验基本公式或者四格表资料的卡方检验专用公式；当n≥40但1≤T＜5时，用卡方检验的连续校正或者Fisher确切概率法；当n＜40或者T＜1时，用Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 左归丸干预化疗源性POF大鼠受孕结果 见表1。

2.1.1 灌胃30、60 d后POF大鼠受孕率比较 化疗结束30 d，与空白组比较，模型组受孕率降低，差异有统计学意义（P=0.001，P＜0.05）；POF左归丸低、中、高剂量组及POF达菲林组受孕率与空白组比较，差异无统计学意义（P值分别为0.105、0.228、0.228、0.061，P＞0.05）。非POF达菲林组及非POF左归丸组受孕率为100%，与空白组一致。与模型组比较，POF左归丸中、高剂量组，非POF达菲林组、非POF左归丸组受孕率均升高，差异有统计学意义（P值分别为0.029、0.029、0.000、0.001，P ＜ 0.05）。POF左归丸低剂量组及POF达菲林组受孕率与模型组比较，差异无统计学意义（P值分别为 0.082、0.206，P＞0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组受孕率与POF达菲林组比较，差异均无统计学意义（P值分别为 0.62、0.335、0.335，P＞0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组灌胃30 d后受孕率组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

灌胃60 d后，与空白组比较，模型组受孕率降低，差异有统计学意义（P=0.021，P＜0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组，POF达菲林组受孕率与空白组比较，差异均无统计学意义（P值分别为 0.070、 1.000、 0.105、 0.105， P＞0.05）。 非POF达菲林组、非POF左归丸组受孕率均为100%，与空白组一致。与模型组比较，非POF左归丸组、非POF达菲林组受孕率均升高，差异有统计学意义（P值分别为 0.021、0.002，P＜0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组，POF达菲林组受孕率与模型组比较，差异均无统计学意义（P 值分别为 1.000、0.057、0.620、0.620，P＞0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组受孕率与POF达菲林组比较，差异均无统计学意义（P值分别为1.000、0.335、1.000，P＞0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组灌胃60 d后受孕率组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

模型组，POF左归丸低、中、高剂量组，POF达菲林组灌胃30 d与60 d后受孕率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），其他各组灌胃30、60 d后受孕率均为100%。

2.1.2 各组大鼠累计受孕率比较 与空白组比较，模型组，POF左归丸低、高剂量组，POF达菲林组累计受孕率降低，差异均有统计学意义（P值分别为 0.000、0.007、0.023、0.003，P ＜ 0.05）。POF左归丸中剂量组累计受孕率与空白组比较，差异均无统计学意义（P=0.132，P＞0.05），考虑中剂量组疗效更佳。非POF达菲林组、非POF左归丸组受孕率均为100%，与空白组一致。与模型组比较，POF左归丸中、高剂量组，非POF达菲林组，非POF左归丸组累计受孕率均升高，差异有统计学意义（P值分别为 0.002、0.027、0.000、0.000，P＜0.05）。POF左归丸低剂量组、POF达菲林组累计妊娠率与模型组比较，差异无统计学意义（P值分别为0.121、0.121，P＞0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组累计受孕率与POF达菲林组比较，差异均无统计学意义（P值分别为1.000、0.094、0.500，P＞0.05）。POF左归丸低、中、高剂量组累计受孕率组间比较，差异均无统计学意义（P=0.286，P＞0.05）。

表1 左归丸干预化疗源性POF大鼠受孕情况Table 1 The results for Zuogui Pills intervening the pregnancy of chemotherapy-induced POF rats

2.2 裸眼观察各组大鼠子宫形态 空白组大鼠子宫宫体红润，呈串珠状，胚胎着床处子宫膨大，充血明显，胚胎着床位点分布相对均匀，大小相对一致；模型组大鼠子宫颜色苍白，宫体细长，怀孕大鼠子宫呈不规则串珠状，充血较空白组少，胚胎着床位点量少且分布不均匀，大小不等；POF左归丸各剂量组大鼠子宫宫体红润，呈串珠状改变，胚胎着床位点分布较空白组稀疏且不均匀，大小相对一致；非POF达菲林组、非POF左归丸组大鼠子宫宫体红润，呈串珠状，充血明显，胚胎着床位点分布均匀，大小相对一致；POF达菲林组大鼠宫体细长，颜色较苍白，胚胎着床位点分布稀疏且不均匀。

3 讨论

CTX引起的生殖功能障碍严重影响患者的生育健康和生存质量，积极防治化疗源性POF、保存女性患者的生育能力的问题具有重要的意义。

中医学认为肾气充盛、冲任和调是卵巢功能表现正常的基础。反之，肾气虚及冲任失调则会导致卵巢功能调节异常或卵巢功能衰竭[6]。本课题组朱玲教授[7]认为肾精亏虚、天癸匮源、冲任虚惫是POF的病机基础，POF的治疗当以补肾为大法。

月经情况、性激素水平、生殖能力都是反映卵巢功能的指征。对于有生育需求的POF女性患者来说，保存或改善生育力是最终目标。

本课题组前期研究[8]发现，左归丸可修复免疫性POF小鼠卵巢免疫性炎症损伤，上调卵泡及卵巢间质Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白的表达，从而抑制卵泡的过快凋亡。另外，有研究[9]表明，左归丸能显著提高CTX化疗源性POF大鼠性激素雌二醇（E2）含量，降低促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）含量，从而改善化疗所致的卵巢功能损害。阳松威等[10]发现左归丸可有效增强CTX致POF模型小鼠卵巢组织Cx37 mRNA表达，上调Cx37蛋白在卵巢组织中的分布与表达，改善化疗致POF模型小鼠卵巢组织缝隙连接功能，恢复卵巢功能。刘秀云等[11]通过动物实验研究左归丸抗CTX毒性，结果显示POF左归丸组FSH较模型组显著下降。临床运用左归丸治疗POF患者，可使患者FSH水平明显降低，AMH值明显升高，有效提高患者卵巢的储备功能[2]。综上可见，左归丸可改善化疗源性POF患者的卵巢功能。但最终能否起到保护患者生育力的作用、保障患者的生殖健康，值得进一步研究。本研究以生育力为观察指标，研究左归丸对CTX化疗源性POF大鼠生育功能的影响。

本研究结果显示模型组受孕率明显低于空白组，表明CTX存在卵巢毒性，可损伤大鼠卵巢功能，降低受孕率；卵巢对细胞毒性药物非常敏感，化疗药物烷化剂CTX可对卵巢造成不可逆的损害。有研究[12]发现使用烷化剂患者约40%发生POF，烷化剂可使年轻女性发生POF的风险增加9倍。吴倩等[8]研究发现CTX化疗源性POF大鼠卵巢体积明显缩小，闭锁卵泡较正常增多，颗粒细胞层减少且排列紊乱。本研究结果还显示，随着时间推移，模型组灌胃60 d后受孕率与灌胃30 d后受孕率比较有一定的提高，但仍然低下，差异无统计学意义（P＞0.05），表明经过CTX的毒性损伤后不经特殊处理，大鼠的卵巢功能虽然有一定的改善，但生育力仍然低下。

本研究结果显示，POF左归丸中、高剂量组灌胃30 d后受孕率及累计受孕率较模型组明显上升，表明左归丸可以提高模型动物的受孕率，改善化疗源性POF大鼠的生育能力，对化疗药物CTX所致大鼠卵巢功能毒性损伤具有一定的治疗作用。

促性腺激素释放激素类似剂（GnRHa）达菲林在临床应用于POF预防和化疗中，对生育力保护是否有效仍存在争议，但使用外源性GnRHa已被证实可抑制内源性促性腺激素FSH至绝经前水平，使卵巢卵泡处于静止状态，减少化疗毒性损伤。有Meta分析[13]显示，使用GnRHa可以显著减少年轻恶性肿瘤患者化疗后POF的风险。本研究结果显示，POF达菲林组灌胃30、60 d后受孕率及累计受孕率与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但受孕率均高于模型组，表明达菲林在一定程度上能提高CTX化疗源性POF大鼠受孕率，改善化疗源性卵巢功能损伤。

本研究结果显示，POF左归丸低、中、高3个剂量组受孕率组间比较，差异无统计学意义。但无论是灌胃30 d、60 d后受孕率或是累计受孕率，POF左归丸中剂量组受孕率均最高，且实验过程中发现POF左归丸中剂量组大鼠的毛发、饮食及日常活动较POF左归丸低、高剂量组表现更佳。POF左归丸中剂量组的灌胃剂量是按照POF左归丸药品说明书中60 kg成年女性的口服剂量18 g/60 kg换算的，本研究结果表明左归丸中剂量治疗化疗药物CTX所致大鼠卵巢功能毒性损伤疗效最佳。提示临床常用剂量治疗POF患者药效可能最佳。剂量降低可能导致疗效降低。剂量增高，疗效未见明显提升。

本研究裸眼观察大鼠子宫形态结果显示，CTX的毒性作用可致大鼠子宫苍白、宫体细长，妊娠率下降，胚胎大小及着床位点不均匀。POF左归丸各剂量组及POF达菲林组均能改善子宫血供，促进胚胎着床，但着床位点与空白组比较相对分布不均、局部可见宫体颜色较苍白。

结合本课题组同期研究成果，认为CTX化疗会降低大鼠受孕率，损伤大鼠卵巢功能，而左归丸可调节化疗源性POF大鼠内分泌水平，促进卵泡及黄体生长，减少卵泡闭锁，抑制卵泡凋亡（另文发表），从而修复卵巢功能，促进胚胎着床，提高受孕率，改善生育能力，对CTX所致大鼠卵巢功能毒性损伤具有一定的治疗作用。基于此，本研究下一步将进一步深入探讨其作用机制以及胚胎毒性（如活产率、畸胎情况）等问题。可见，中医药防治POF是一个具有发展前景的研究方向，对防治化疗源性POF、保存年轻女性患者生育力、提高生活质量具有重要意义。