N-乙酰半胱氨酸对抗碘普罗胺诱导的肾小管上皮细胞损伤的机制研究

陈燕玲,罗 婷,高昕乐,陈 阳,吴秀香,凡 栋,艾 寒,靳俊峰,庄晓东

作者单位：519041珠海，遵义医科大学珠海校区基础病理生理学教研室[陈燕玲（理学博士）、罗 婷、高昕乐、吴秀香、凡 栋、艾 寒、靳俊峰]；519041珠海，遵义医科大学珠海校区珠海市中药基础及应用研究重点实验室（陈 阳）；510080广州，中山大学附属第一医院心血管内科(庄晓东)

0 引 言

对比剂肾病是在诊断和介入手术中应用含碘对比剂后发生的重要并发症，是引起医源性急性肾功能衰竭的常见病因，占所有急性肾功能衰竭患者总人数的12%［1］。对比剂肾病的发病机制复杂，目前认为对比剂肾病的发生主要与对比剂对肾小管的直接毒性作用，肾脏内微血管的改变，氧化应激及炎症等有关［2-5］。在这些因素中，越来越多的研究证实炎性损伤在对比剂肾病发生发展中发挥着重要作用。最近一项研究指出，Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）-NOD样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体通路是对比剂肾病发生的关键机制之一。用碘普罗胺建立的大鼠急性肾衰竭模型及NRK-52E细胞损伤模型中，TLR4蛋白及NLRP3炎症小体相关蛋白表达均增加，而加入TLR4抑制剂及NLRP3-siRNA后，可以改善碘普罗胺引起的肾损伤［6］。我们前期的研究也发现，经碘普罗胺诱导的HK-2细胞NLRP3炎症小体相关蛋白表达均明显增加，说明NLRP3炎症小体的激活参与了对比剂肾病的发生［7］。

N-乙酰半胱氨酸（N-Acety-L-Cysteine，NAC）是临床常用药，主要用于治疗慢性呼吸道感染，具有抗氧化及抗炎作用［8］。目前，尽管对NAC预防对比剂肾病发生的作用还存在争议，但许多临床试验表明NAC结合水化治疗在对比剂肾病的防治中具有良好的效果［9］。本实验以HK-2细胞作为研究对象，观察NAC对碘普罗胺诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用，为NAC防治对比剂肾病提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养HK-2细胞株由中山大学高血压研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，取对数生长期且状态良好的细胞进行实验。

1.1.2 实验材料及试剂0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM/F12培养基及胎牛血清为美国Gibco公司产品；细胞裂解液试剂盒（RIPA裂解液）为上海碧云天试剂公司产品；CCK-8细胞活力检测试剂盒为日本同仁化学研究所产品；NAC及DCFH-DA为美国Sigma公司产品；碘普罗胺（碘浓度为370 mgI/mL）为拜耳医药公司产品；Bax、Bcl-2、NLRP3、IL-1β、Caspase-1、核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及内参GAPDH等Ⅰ抗及相应的Ⅱ抗为美国CST公司产品；ASC抗体为美国Absin公司产品。ECL超敏发光液为北京普利莱基因技术有限公司产品。

1.1.3 实验仪器 荧光倒置显微镜为德国OLYMPUS公司产品；流式细胞仪为德国PARTEC公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 分为对照组、碘普罗胺组（加入111 mgI/mL碘普罗胺处理24 h）、碘普罗胺+不同浓度NAC处理组（111 mgI/mL碘普罗胺与2、4、8、16、32 mmol/L NAC共孵育24 h）。碘普罗胺及NAC浓度设置文献［7］及前期实验结果［10］。

1.2.2 CCK-8检测细胞存活率HK-2细胞按2×105个/mL接种于96孔板，待细胞贴壁并长至铺满孔底约85%时，根据实验分组加入不同浓度的NAC及碘普罗胺。24 h后吸出培养基，每孔加入100 μL CCK-8溶液（用无血清培养基配制，培养基与CCK-8的比例为1∶9），继续培养1.5 h，用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的吸光度值（A值），计算细胞存活率，公式如下：

1.2.3 细胞内ROS水平检测HK-2细胞按3×104个/mL接种于6孔板，待细胞贴壁并长至铺满孔底约85%时，根据实验分组加入不同浓度的NAC及碘普罗胺处理24 h。每孔加入1 mL终浓度为1 μg/L的DCFH-DA，避光孵育30 min后，弃培养基，用胰酶消化细胞并收集至15 mL离心管中，用PBS洗3次，去除没有装载到细胞内的DCFH-DA染料，离心后用PBS重悬，流式细胞仪分析细胞平均荧光强度。

1.2.4 DAPI染色法观察细胞核形态HK-2细胞按3×104个/mL接种于6孔板，待细胞贴壁并长至铺满孔底约85%时，根据实验分组加入不同浓度的NAC及碘普罗胺处理。24 h后弃培养基，用4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，每孔加入1 mL终浓度为1 μg/L的DAPI，避光孵育20 min后，吸出染色液，PBS洗3次去除多余的染色液，荧光显微镜下观察细胞核形态并随机选取8个不同的视野进行拍照。

1.2.5 Western blot检测HK-2细胞按3×103个/mL接种于10 cm培养皿中，按实验分组加入不同浓度的NAC及碘普罗胺处理24 h后，用PBS洗3次，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞。蛋白定量后每组取60μg蛋白加入上样缓冲液，沸水中煮5min，使蛋白质完全变性和解聚。根据目的蛋白分子量配制不同百分比的聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳（8%～12%），电泳条件：80 V恒压，30 min；然后120 V恒压，60～80 min；电转：220 mA恒流转60～120 min。电转至PVDF膜后，用5%脱脂奶粉封闭60 min，依次加入相应的Ⅰ抗（Bax、Bcl-2、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、NF-κB、GAPDH）和辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，Ⅰ抗在4℃下孵育过夜，Ⅱ抗在室温下孵育60 min，TBST洗3次，每次10 min。加入ECL发光液放入暗盒中压片显影或经Jena成像仪扫描成像，再经ImageJ软件分析各组条带的灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用LSD-t法，以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 NAC对碘普罗胺诱导的HK-2细胞存活率的影响 与对照组的细胞存活率（100%±4.749%）比较，碘普罗胺组HK-2细胞细胞存活率（48.819%±2.045%）明显降低；与碘普罗胺组比较，加入2、4、8、16、32 mmol/L的NAC处理后，细胞存活率（55.40%±3.61%、58.95%±2.86%、61.53%±5.18%、59.85%±6.37%、59.09%±6.29%）明显增高（P＜0.05）。

2.2 NAC对碘普罗胺诱导的Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 与对照组相比，碘普罗胺组HK-2细胞Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax/Bcl-2比值明显增高（P＜0.05）；与碘普罗胺组相比，不同浓度的NAC处理组Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，Bax/Bcl-2比值明显降低（P＜0.05）。见表1，图1。

图1 NAC对碘普罗胺诱导的Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Figure 1Expressions of Bax and Bcl-2 proteins in different groups of the HK-2 cells

表1 各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值(xˉ±s,n=3)Table 1Expressions of Bax and Bcl-2 proteins and Bax/Bcl-2 ratios in different groups of the HK-2 cells(xˉ±s,n=3)

2.3NAC对碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡的影响 用DAPI染色观察细胞核形态，结果发现对照组细胞经DAPI染色后细胞核呈现均匀的低密度蓝色荧光。经碘普罗胺处理后，部分细胞核呈现局部致密浓染的蓝色荧光，并且出现核固缩或核分裂等凋亡细胞的典型特征，而加入不同浓度的NAC处理后，出现核固缩或核分裂的细胞数明显减少，见图2。

2.4 NAC对碘普罗胺诱导的HK-2细胞细胞内ROS水平的影响DCFH-DA染料经水解及ROS氧化后可生成带绿色荧光的DCFH。DCFH的含量与细胞内ROS水平呈正比，DCFH含量越高，绿色荧光强度越强。流式细胞仪检测各组细胞的平均荧光强度结果显示，与对照组的平均荧光强度（1502.17±55.91）相比，碘普罗胺组细胞内平均荧光强度（5050.85±606.76）明显增强；而加入2、4、8、16、32mmol/L的NAC处理后，细胞内平均荧光强度（4065.39±160.59、4162.05±28.93、3675.71±50.38、3133.97±66.07、2675.80±92.39）较碘普罗胺组明显减弱（P＜0.05），见图3。

2.5 NAC对碘普罗胺诱导的HK-2细胞NLRP3炎症小体相关组分及NF-κB蛋白表达水平的影响Western blot结果显示，与对照组相比，碘普罗胺组HK-2细胞NLRP3炎症小体相关组分（NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β）及NF-κB蛋白表达水平均明显增高，而不同浓度的NAC处理组上述蛋白表达水平较碘普罗胺组明显降低（P＜0.05），见表3，图4。

图2 NAC对碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡的影响（×400）Figure 2Apoptosis rates of the HK-2 cells in different groups（×400）

图3 流式细胞仪检测细胞内ROS水平Figure 3Levels of ROS in different groups of the HK-2 cells

表3 各组细胞NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β蛋白表达水平(xˉ±s,n=3)Table 3Expressions of NF-κB,NLRP3,ASC,Caspase-1 and IL-1β proteins in different groups of the HK-2 cells(xˉ±s,n=3)

图4 NAC对碘普罗胺诱导的HK-2细胞NF-κB及NLRP3炎症小体相关组分蛋白表达水平的影响Figure 4Expressions of NLRP3，ASC，Caspase-1 and IL-1β proteins in different groups of the HK-2 cells

3 讨 论

本课题组前期已报道用不同浓度（37、74、111、148 mgI/mL）的碘普罗胺处理HK-2细胞24 h后，细胞存活率呈剂量依赖性下降，可以成功构建HK-2细胞损伤模型［7］。因此，本实验中采用111mgI/mL浓度的碘普罗胺处理24 h作为本研究中对比剂肾病体外模型的条件。

研究报道，对比剂可以破坏肾小管上皮细胞线粒体酶活性并诱导线粒体膜电位下降，细胞色素C从线粒体释放到胞浆，继而启动细胞凋亡过程［11］。而预防性口服抗氧化剂乙酰半胱氨酸可以有效降低慢性肾功能不全者对比剂肾病的发病率［12］。本研究中，用111 mgI/mL浓度的碘普罗胺处理HK-2细胞24 h后，细胞活力明显降低，Bax/Bcl-2比值明显增高，凋亡细胞数明显增多，说明碘普罗胺可诱导HK-2细胞发生凋亡。而加入NAC后，上述效应明显减弱，说明NAC可以对抗碘普罗胺诱导的HK-2细胞损伤。

越来越多的证据表明，由炎症体激活介导的炎症反应参与急性肾损伤中的细胞凋亡及细胞功能障碍。这些蛋白复合物是固有免疫的重要组分，可以激活促炎因子IL-1β和IL-18。在众多已知的炎症体中，NLRP3炎症小体是目前研究最多的炎症体，在多种肾损伤模型中均显示NLRP3炎症小体具有损伤作用。研究报道，与野生型小鼠相比，NLRP3基因敲除小鼠肾小管损伤和炎症反应明显减轻［13］。缺血-再灌注可诱导小鼠肾组织中NLRP3的表达增高，NLRP3基因敲除可显著改善缺血再灌注诱导的急性肾损伤，包括减轻急性肾小管坏死，下调IL-18和IL-1β的表达及降低死亡率［14］。最近研究报道NLRP3在对比剂诱导的急性肾损伤和细胞凋亡中起着至关重要的作用。活化的NLRP3可以诱导自身寡聚化并募集含有半胱天冬酶募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及Caspase-1，组成NLRP3炎症小体［15］。被NLRP3激活的Caspase-1具有促炎效应，可以将IL-1β和IL-18前体剪切加工成成熟和活性形式，进一步诱导炎症反应。而沉默NLRP3或ASC基因后，可以减轻由威视派克或欧乃派克对比剂引起的肾小管上皮细胞损伤及凋亡［16］。NF-kB和NLRP3炎性小体通路形成信号轴，IL-1β和IL-18前体的产生依赖于NF-κB信号通路的激活，而NF-κB抑制剂可以抑制NLRP3的生成［17］。在本研究中，HK-2细胞经111 mgI/mL浓度的碘普罗胺诱导后，NF-κB表达明显增加，NLRP3炎症小体被激活，Caspase-1及IL-1β表达明显增高，而加入NAC后，上述蛋白表达明显降低。提示NAC可以抑制NF-κB/NLRP3信号轴。

ROS在对比剂引起的肾损伤中具有重要作用。对比剂可引起肾脏缺血-缺氧及氧化应激。肾髓质缺血可以加速活性氧（ROS）的产生，ROS产生增多会引起肾小球滤过率降低［2，18］。ROS是NLRP3炎症小体激活的触发剂，当ROS浓度增加时，硫氧还蛋白互作蛋白可与NLRP3结合，继而激活NLRP3［20］。在本研究中，HK-2细胞经碘普罗胺处理后，细胞内ROS水平明显升高，而经NAC处理后，细胞内ROS水平明显降低。提示NAC可能通过抑制ROS的产生抑制NLRP3炎症小体的激活。

综上所述，NAC可以减轻碘普罗胺诱导的肾小管上皮细胞损伤，其机制可能与其抑制ROS生成及NF-κB/NLRP3信号通路的激活有关。