亚低温干预对大鼠颅脑创伤后钙调蛋白表达和脑水肿的影响

廖 帅，郑晓梅，丁华强，汪棋笙，张 烨，何济民，李祥龙，陈礼刚，江 涌，刘 亮

作者单位：646000泸州，西南医科大学附属医院神经外科[廖 帅（医学硕士研究生）、丁华强、张 烨、何济民、李祥龙、陈礼刚、江 涌、刘 亮]，神经内科（郑晓梅）；646200合江，合江县人民医院神经外科（汪棋笙）

0 引 言

颅脑创伤是一种常见的外伤性疾病，发病率逐年增加且致死率致残率均据外伤性疾病之首［1-4］。钙调蛋白是存在于真核细胞中一种与钙离子（Ca2+）结合的受体蛋白，可介导调控多种病理生理过程。颅脑创伤后神经细胞Ca2+超载是颅脑创伤继发性脑损伤的重要始动环节，大量内流的Ca2+与高度表达的钙调蛋白结合形成复合物后介导并调控一系列神经细胞损伤［5-6］。而亚低温治疗是已被国内外广泛接受的脑保护措施，可减轻颅脑创伤后的继发性脑损伤，发挥脑保护作用［7-8］。本研究旨在探讨亚低温对大鼠颅脑创伤后钙调蛋白表达的影响并探讨其保护机制，观察对脑水肿的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取90只成年健康SD大鼠，雌雄不限，体重270～300 g，均来自西南医科大学动物研究中心，实验动物许可证：SYXK（川）2013-181，标准条件饲养。该研究符合动物伦理原则。随机分为常温组（37℃，击打制作颅脑创伤模型）、亚低温组［（32±0.5）℃，击打制作颅脑创伤模型］，假手术组（37℃，仅开骨窗，不击打），每组30只。各组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。CCI颅脑创伤仪（美国 PSI），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（北京TaKa-Ra），兔抗鼠Anti-Calmodulin、兔抗鼠Anti-GAPDH抗体和山羊抗兔IgG H&L HRP（英国abcam），蛋白Marker（美国 Thermo Fisher），SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒、ECL化学发光试剂盒、0.2 μm PVDF膜、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物），Loading Buffer、脱脂奶粉、山羊血清（北京索莱宝科技）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 实验前大鼠禁食12 h，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量30 mg/kg。麻醉后剪去头部术区毛发，将大鼠以俯卧位置于立体定向仪，皮肤消毒，沿中线剪开皮肤，暴露颅骨并剖离骨膜，于颅骨中线右方2.5 mm，冠状缝后2.5 mm处用颅钻开一直径约5 mm骨窗，暴露硬脑膜并保持完整。使用CCI颅脑创伤仪击打，击打深度为2.5 mm，速度4.5 m/s，接触时间100 ms。击打后骨蜡修补骨窗，假手术组开骨窗不作打击，骨窗修补后缝合皮肤。将亚低温组大鼠置于冰床并以0℃冰水浸浴，乙醇擦拭，测量并维持肛温（32±0.5）℃，持续6 h。

1.2.2 大鼠改良神经功能评分 各组随机取6只大鼠于建模后1、3、5、7d行大鼠改良神经功能评分（modified neurological function score，mNSS），评分项目：感觉试验（2分）、反射缺陷（4分）、运动试验（6分）平衡木试验（6分），共18分，评分越高神经功能越差［9-10］。

1.2.3 MRI检测及脑组织取材 各组取剩余大鼠分别于6、12、24、48h各取6只，以3%水合氯醛麻醉后行3.0TMRI检查，采用飞利浦Achieva3.0T磁共振成像系统和大鼠专用头颅线圈，T2W：TR4.0s，TE100ms，层数9层，层厚1.5 mm，层间距0.3 mm，反转角90°，成像时间4分8秒，原始图像传输至工作站后划出T2W高信号区为损伤灶和水肿区，软件计算各层面相应面积，损伤水肿区体积=各层面损伤水肿区面积和×（层厚+层间距）［11］，检查完毕后大鼠处死后取脑组织，备用。

1.2.4 Western bolt测定CAM表达 各组各时间点取50 mg脑组织样本，加入500 μL组织细胞裂解液和5 μLPMSF，置于研磨仪研磨后冰上裂解10 min，14000转/min离心15 min后将上清液转移到EP管，并使用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。EP管按比例加入Loading Buffer后震荡离心并100℃煮沸10 min，置于-80℃保存。根据浓度确定上样量后依次上样，SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶15%，浓缩胶5%，电泳结束后将胶转移至甲醇浸泡1 min后的PVDF膜上，转膜条件：恒压100 V，40 min，膜孔径0.2 μm，转膜后 PBST洗5 min，脱脂奶粉封闭1.5 h，PBST洗3次，每次5 min。孵育一抗：兔抗鼠Anti-Calmodulin，兔抗鼠Anti-GAPDH抗体，4℃冰箱摇床过夜，PBST洗5次，每次5 min，加入二抗山羊抗兔IgG H&L HRP，PBST洗5次，每次6 min，ECL发光液均匀覆盖，运用红外激光成像系统显影曝光，对目的和内参蛋白进行半定量分析，运用Image J软件测定灰度值，蛋白表达量用CAM/GAPDH表示。

1.2.5 免疫组织化学法 各组各时间点大鼠取脑后脑组织立即放入4%多聚甲醛避光固定12 h，之后蔗糖溶液常规脱水，石蜡包埋，脑组织石蜡块行冠状位切片，厚度4 μm，行免疫组化染色：①脱蜡，60℃烤箱烤片30 min；②水化，二甲苯I 10 min，二甲苯II 8 min，二甲苯III 8 min，95%乙醇5 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，蒸馏水洗3次，5 min/次，PBS洗3次，5 min/次；③热抗原修复，配置柠檬酸钠抗原修复液，高压锅煮沸后放入玻片，缓慢升压维持15 min，自然冷却，PBS洗3次，5 min/次；④灭活 ，3%H2O2，37 ℃10 min，PBS洗3次，5 min/次；⑤封闭，山羊血清室温封闭10 min，倾去多余液体；⑥一抗兔抗鼠 Anti-Calmodulin，1∶2000，4℃过夜，PBS洗3次，5 min/次，滴加二抗山羊抗兔IgG，1∶1000，室温30 min，PBS洗3次，5 min/次；⑦加入辣根过氧化物标记链霉素卵白素工作液，室温30 min，PBS洗3次，5 min/次；⑧DAB显微镜下显色5～10 min，水冲洗10 min；⑨脱水、干燥、封片、镜检。各组各时间点选取5张切片，显微镜下每张任选10个完整不重复的400倍视野，计数有棕黄色颗粒或斑片的阳性细胞并取平均数。

1.2.6 荧光定量PCR 各组各时间点于冰上取约100 mg组织，于1 mL预冷的Trizol中充分研磨，匀浆液转入1.5 mL EP管中，加入250 μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min，溶液离心10 000×g，10 min。吸取上清液500 μL于1.5 mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇并混匀，-20℃静置15 min。溶液4 ℃，10 000×g，10 min离心，倒去液体，加入1 mL 4℃预冷75%乙醇并混匀，清洗RNA沉淀，4℃，10 000×g，5 min离心，倒去液体，干燥，加入10 μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。运用260 nm波长分光光度仪测定RNA浓度。按试剂说明书进行反转录，Calmodulin的上游引物为5′-TTGATAAAGATGGGGACGGC-3′，下 游 引 物 为 5′-CTGATGTAGCCATTGCCATCC-3′，内参GAPDH的上游引物为 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物为 5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。取样本 1 μL，引物工作液1 μL，2× qPCR 预混液5 μL，ddH2O 2.8 μL，Rox0.2 μL配置反应体系，反应程序为：预变性95 ℃，1 min；95 ℃，15 s→58 ℃，20 s→72 ℃，45 s循环40次；熔解曲线为60℃→95℃，每20 s升温1℃。运用ΔΔCT法进行数据处理。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，定量资料使用均数标准差（xˉ±s）描述，多个时间点组间均值的比较使用重复测量方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 改良神经功能评分 亚低温组、常温组各时间点mNSS评分较假手术组明显升高（P＜0.05），大鼠表现出明显的神经功能行为障碍。亚低温组各时间点mNSS评分较常温组明显减轻（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组各时间点钙调蛋白 mRNA及蛋白的表达 常温组、亚低温组大鼠各时间点钙调蛋白mRNA及蛋白的表达量较假手术组明显升高（P＜0.05）。亚低温组各时间点蛋白表达量较常温组明显降低（P＜0.05）。亚低温组大鼠6、12、24 h后钙调蛋白mRNA较常温组明显降低（P＜0.05），48 h时钙调蛋白mRNA与常温组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1，表2。

表1 大鼠各组各时间点mNSS评分Table 1 Modified neurological severity scores of different groups of rats at different days(xˉ±s，score)

表1 大鼠各组各时间点mNSS评分Table 1 Modified neurological severity scores of different groups of rats at different days(xˉ±s，score)

与假手术组比较，*P＜0.05；与常温组比较，#P＜0.05

组别假手术组常温组亚低温组n666 1 d 0 11.53±1.60*8.84±0.75*#3 d 0 9.72±1.15*7.50±0.62*#5 d 0 7.61±0.92*5.71±0.55*#7 d 0 5.38±.0.70*4.05±.0.42*#

图1 Western bolt测定钙调蛋白表达Figure 1 Expression of the CAM protein in the brain tissue of different groups of rats at different hours

表2 大鼠各组各时间点钙调蛋白mRNA相对定量结果Table 2 Expression of CAM mRNA in the brain tissue of different groups of rats at different hours(xˉ±s)

表2 大鼠各组各时间点钙调蛋白mRNA相对定量结果Table 2 Expression of CAM mRNA in the brain tissue of different groups of rats at different hours(xˉ±s)

与假手术组比较，*P＜0.05；与常温组比较，#P＜0.05

组别假手术组常温组亚低温组n 24 24 24 mRNA表达量6 h 1.06±0.07 2.76±0.25*1.83±0.19*#12 h 1.04±0.05 2.49±0.18*1.72±0.12*#24 h 1.00±0.02 2.04±0.14*1.59±0.06*#48 h 0.95±0.04 1.65±0.09 1.60±0.07蛋白表达量6 h 0.629±0.026 1.124±0.038*0.919±0.018*#12 h 0.633±0.020 1.149±0.031*0.943±0.025*#24 h 0.626±0.020 0.932±0.029*0.707±0.021*48 h 0.632±0.023 0.876±0.020*0.731±0.016*#

2.3 各组各时间点脑组织免疫组化结果 假手术组钙调蛋白表达微弱，常温组、亚低温组各时间点的免疫组化钙调蛋白表达较假手术组增加（P＜0.05），亚低温组各时间点免疫组化钙调蛋白表达量较常温组下降（P＜0.05），结果与Western blot检测结果符合，见表3，图2。

2.4 各组各时间点大鼠脑组织MRI 假手术组大鼠脑组织MRI表现正常，无异常信号影，脑组织结构完好；常温组大鼠颅脑创伤后脑组织有明显挫伤伴水肿形成，皮质连续性破坏；亚低温组大鼠颅脑创伤后脑水肿程度和范围较常温组明显降低，见表4，图3。

表3 大鼠各组各时间点免疫组化钙调蛋白表达情况Table 3 Expression of the CAM protein in the brain tissue of different groups of rats at different hours

表3 大鼠各组各时间点免疫组化钙调蛋白表达情况Table 3 Expression of the CAM protein in the brain tissue of different groups of rats at different hours

与假手术组比较，*P＜0.05；与常温组比较，#P＜0.05

组别假手术组常温组亚低温组n 24 24 24 6 h 28.34±3.25 86.32±5.23*66.83±4.62*#12 h 30.25±2.17 95.68±5.88*71.65±5.06*#24 h 29.29±2.78 72.51±4.92*58.81±3.98*#48 h 29.72±2.61 65.72±4.81*49.92±3.65*#

图2 各组大鼠不同时间点免疫组化结果Figure 2 Expression of CAM mRNA in the brain tissue of different groups of rats at different hours

表4 大鼠各组各时间点脑组织损伤水肿区体积(xˉ±s，mm3)Table 4 Volume of brain edema in the brain tissue of different groups of rats at different hours(xˉ±s，mm3)

图3 大鼠脑组织MRI表现Figure 3 MRI manifestations of the brain tissue in different groups of rats at different hours

3 讨 论

颅脑创伤后兴奋性氨基酸增加和神经细胞凋亡异常激活，抑制凋亡可能改善神经细胞坏死和脑损伤预后［12］。而钙调蛋白可调控兴奋性氨基酸如Glu的释放，激活细胞异常凋亡，从而造成神经细胞坏死［13］。从而我们推测颅脑创伤的机制和钙调蛋白存在密切联系。

亚低温能改善颅脑创伤后的神经功能恢复，通过抑制炎症反应、细胞凋亡，减少组织耗氧量等机制，降低颅内压，保护血脑屏障，发挥脑保护作用［14-16］。颅脑创伤后兴奋性氨基酸大量释放造成“兴奋性毒性”引起继发性脑损伤，而亚低温能降低颅脑创伤后兴奋性氨基酸受体如NMDAR1表达［17］。而钙调蛋白可通过钙调蛋白依赖激酶II增加兴奋性氨基酸受体NMDAR的活性且增加兴奋性氨基酸的释放［18］。所以我们推测亚低温的脑保护机制和钙调蛋白存在关系并进行本研究。

尽管钙调蛋白在颅脑创伤机制中起重要作用，但关于亚低温干预颅脑创伤后钙调蛋白的表达相关研究较少。本研究发现，亚低温组较常温组同时间点神经功能行为障碍减轻、mNSS降低，说明亚低温在颅脑创伤后大鼠的生物行为学表现上起到了积极作用。常温组、亚低温组各时间点钙调蛋白mRNA及蛋白表达均较假手术组明显上调，相关研究显示钙调蛋白可以通过调控自由基生成、NO的释放、兴奋性氨基酸的释放、细胞凋亡等途径参与神经细胞损伤。钙调蛋白可激活钙调蛋白依赖激酶II（CAMKII），激活下游信号通路，包括上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达，合成NO，加重氧化应激和自由基生成，生成的神经毒性物质可造成细胞功能不全和血管受损等一系列继发损伤［19］，本研究结果说明颅脑创伤可能通过增加钙调蛋白表达激活上述各种损伤途径导致神经细胞死亡。这也与黄博聪等［20］研究结果基本相符。亚低温组48 h的钙调蛋白mRNA与常温组48 h差异无统计学意义，与预想结果存在差异，原因可能是6 h亚低温干预较48 h不够持续，影响了亚低温对钙调蛋白mRNA转录的抑制；但在蛋白表达层面，亚低温组48 h较常温组48 h钙调蛋白表达降低，推测亚低温对钙调蛋白的抑制可能在转录后的层面起更主要作用，或是抑制钙调蛋白翻译，或是增加降解钙调蛋白的蛋白酶活性等。Western blot和免疫组化结果显示亚低温组各时间点钙调蛋白蛋白表达量均较同时间点常温组下降，说明亚低温在蛋白分子层面发挥了生物学功能，降低钙调蛋白表达，可能通过抑制了上述一系列颅脑创伤继发性脑损伤机制［19］，发挥脑保护作用。

颅脑创伤后脑水肿是导致脑组织结构功能改变和脑组织损伤的重要原因［21］，MRI结果显示6 h脑水肿已开始形成并加重，48 h达到水肿高峰且存在继续加重可能，亚低温组脑水肿程度和范围较常温组明显降低，可能是亚低温降低细胞耗氧，降低炎症反应，减轻酸中毒和自由基产生，抑制血红蛋白外渗和水电解质失衡，从而维护了正常脑血流量并起到保护血脑屏障的作用，减轻颅脑创伤后脑水肿［14］，降低颅内压，这也与江基尧［22］等的临床研究结论相符。

综上所述，本研究证实了大鼠颅脑创伤后钙调蛋白mRNA上调且钙调蛋白表达增加，亚低温干预减轻了颅脑创伤后脑水肿并抑制了钙调蛋白表达，提示了亚低温通过抑制钙调蛋白表达影响颅脑创伤的损伤机制，发挥脑保护作用，本研究进一步为亚低温治疗颅脑创伤的临床疗效提供理论支持。