丙戊酸钠对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织中金属基质蛋白-9及水通道蛋白4表达的影响

汪棋笙，丁华强，廖 帅，何济民，张 烨，侯黎明，刘 亮

作者单位：646000泸州，西南医科大学附属医院神经外科［汪棋笙(医学硕士研究生，现在合江县人民医院神经外科工作)、丁华强、廖 帅、何济民、张 烨、刘 亮]；646200泸州，合江县人民医院神经外科（侯黎明）

0 引 言

全世界每年有1000万人受到创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的影响［1］。颅脑损伤后血脑屏障破坏在脑损伤后继发性损伤中伴有重要作用，而金属基质蛋白9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在保持血脑屏障完整性中发挥着重要作用，MMP-9与血脑屏障的破坏及脑水肿程度呈正相关［2］。水通道蛋白4（aquaporin 4 ，AQP4）为水通道蛋白家族的一员，可以控制水分流入和流出脑实质，在脑外伤后脑水肿的过程中发挥着重要作用［3］，抑制AQP4表达对脑损伤的进一步恶化具有保护作用［4］。研究发现，丙戊酸钠（valproic acid VPA）具有神经保护作用，在脑缺血及蛛网膜下腔出血模型中，VPA都能明显抑制MMP-9表达，巩固紧密连接蛋白而发挥保护血脑屏障的作用［5-6］。但在大鼠创伤性颅脑损伤模型中，VPA能否通过降低脑损伤后MMP-9、AQP4表达发挥脑保护作用目前国内外未见报道较少。因此，本研究旨在研究VPA对大鼠脑损伤模型脑组织中AQP4、MMP-9蛋白表达的影响，探讨其脑保护作用，为VPA后期应用于临床神经保护研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验采用SD雄性大鼠，6～8周，体重250～300g，清洁级，实验动物许可证号：SYXK（川）2013-181，由西南医科大学动物研究中心提供。标准条件下饲养：温度20～28℃，每天给予充足全价营养饲料及清洁饮用水。100只SD大鼠被随机数字表法分成5组，每组20只：假手术组，外伤模型组（TBI），VPA 低浓度组（TBI+30 mgVPA），VPA中浓度组（TBI+150 mgVPA），VPA高浓度组（TBI+300 mgVPA）。每组20只按术后24 h、3 d、7 d、14 d时间点分为4个亚组，每组5只。

1.2 方法

1.2.1 制作颅脑损伤模型 采用控制性皮层撞击损伤模型（controlled cortex impact，CCI）法制作中型颅脑损伤模型［7］，撞击参数（撞击速度3.5 m/s，撞击探头直径3 mm，撞击深度3 mm，接触时间0.5 s）。假手术组与造模组程序相同，但不行硬膜外撞击。麻醉清醒后给药组立即分别予VPA 30、150、300 mg/kg胃饲1次，此后每日给药分2次进行，即15、75、150 mg/kg胃饲12 h/次，连续7 d。

1.2.2 取材 每组大鼠术后饲养24 h、3 d、7 d、14 d时间点取材。取材前按改良神经系统功能评分，评分后处死大鼠，于挫伤处脑组织中心处冠状切开（假手术组于骨孔中心处冠状切开），于后半部分脑挫伤周围2 mm取约（30±5）mg行Western blot方法检测AQP4、MMP-9含量，剩余部分采用干湿重法行脑组织含水测定。前半部分采用免疫组化法测AQP4、MMP-9。其中，各取材组24 h、3 d、7 d断头取脑前抽取颈内静脉全血行VPA血药浓度检测。

1.2.3 改良神经功能缺损评分 采用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）对大鼠进行运动感觉及反射功能检查，最高分18分，分值越高说明损伤越重，由对试验分组不知情的人员进行评分。

1.2.4 脑组织含水量测定 采用干湿重法测脑组织含水量，将脑组织于挫伤中心处冠状切开取后半剩余部分脑组织置于培养皿内电子分析天平上测湿重（精确到0.1 mg），测重后于60℃烤箱内烘烤48 h至恒重。

1.2.5 VPA血药浓度检测 抽取颈内静脉血，离心半径8 cm、3500 r/min离心5 min，取上清液，-20℃冻存备用。收集完所有标本后交检验科，由不明分组情况检验人员进行检测。检测采取酶放大免疫测定法进行。

1.2.6 Western blot法测AQP4、MMP-9 蛋白提取：取脑组织挫伤边缘处（30±5）mg，按脑组织∶裂解液=20 mg∶200 μL，以全自动快速研磨仪以60 HZ研磨100 s提取蛋白。蛋白浓度测定：采用BCA法测定样品蛋白浓度。Western blot分析：上样每孔取5 μL，以后根据内参灰度值调整样品上样量至内参灰度值对等。采用湿转法转膜，转膜1 h后5%脱脂奶粉封闭后，分别加入AQP4一抗（兔抗鼠1∶1000）、MMP9一抗（兔抗鼠1∶1000）、Tubulin内参抗体（1∶1000）4℃孵育过夜。PBST洗涤3次，每次5 min，加入二抗（抗兔1∶3000）。洗涤后加上发光试剂，放入发光机发光显色，软件分析。以目标条带/内参条带灰度值定量作统计学分析。

1.2.7 免疫组化法测AQP4、MMP-9表达 取材后立即以甲醛固定，经石蜡包埋、切片、脱蜡、抗原修复、消除内源性过氧化酶活性、每张切片加入兔抗鼠一抗孵育，27℃孵育60 min，PBS洗涤，加入羊抗兔二抗孵育，27℃孵育30 min。PBS洗涤后DAB显色剂室温下显微镜下控制显色5～10 min，苏木精复染2 min，1%稀盐酸分化，饱和碳酸锂反蓝。脱水、透明、封固后显微镜下取图。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ± s）表示，采用两因素析因设计方差分析对各指标进行分析，确定时间点后，多组间比较采用单因素方差分析，并用SNK法进行组间两两比较，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 手术后假手术组、TBI组，VPA低、中、高浓度组死亡率分别为0、10.0%、0、5.0%、0，差异无统计学意义（P＞0.05）。假手术组、TBI组VPA血药浓度为0，VPA低、中、高浓度组分别为：（6.25±3.67）、（28.4±5.46）、（55.63±8.2）μg/mL。

2.2 改良神经功能缺损评分结果 与TBI组相比，伤后各时间点，VPA中、高浓度组的mNSS评分均下降（P＜0.05），VPA低浓度组差异无统计学意义（P＞0.05）；VPA低、中、高浓度组各时间点mNSS评分逐渐降低，两两比较的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠mNSS评分（，n=5）Table1 Modified Neurological Severity Scores(mNSS)of different groups of rats at different time points（xˉ±s,n=5）

表1 不同时间点各组大鼠mNSS评分（，n=5）Table1 Modified Neurological Severity Scores(mNSS)of different groups of rats at different time points（xˉ±s,n=5）

与假手术组相比，*P＜0.05；与 TBI组相比，#P＜0.05；与VPA低浓度组比较，△P＜0.05；与VPA中浓度组比较，▲P＜0.05

分组假手术组TBI组VPA低浓度组VPA中浓度组VPA高浓度组不同时间mNSS评分24 h 1.2±0.4 8.4±0.9*7.8±0.3*6.2±1.3*#△4.6±1.3*#△▲3 d 1.4±0.5 7.0±0.7*6.8±0.8*5.4±1.1*#△3.8±1.3*#△▲7 d 1.2±0.4 5.8±1.0*6.2±0.8*4.6±1.1*#△3.0±0.7*#△▲14 d 1.2±0.4 4.5±1.3*5.0±0.7*3.8±0.1.0*#△1.8±0.8#△▲

2.3 脑组织含水量检测结果 伤后24 h、3 d、7 d，与TBI组相比，VPA中、高浓度组脑组织含水量降低（P＜0.05）。VPA各浓度组各时间点大鼠脑含水量逐渐降低，两两比较的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同时间点各组大鼠脑含水量比较（，%，n=5）Table 2 Water contents in the brain tissue of different groups of rats at different time points（xˉ±s，%，n=5）

表2 不同时间点各组大鼠脑含水量比较（，%，n=5）Table 2 Water contents in the brain tissue of different groups of rats at different time points（xˉ±s，%，n=5）

与假手术组相比，*P＜0.05；与 TBI组相比，#P＜0.05；与VPA低浓度组比较，△P＜0.05；与VPA中浓度组比较，▲P＜0.05

分组假手术组TBI组VPA低浓度组VPA中浓度组VPA高浓度组不同时间点大鼠脑含水量24 h 70.7±0.5 79.6±0.8*79.6±0.8*77.6±0.7*#△76.2±0.7*#△▲3 d 70.8±1.6 82.6±0.8*82.5±0.7*78.7±0.9*#△76.9±1.7*#△▲7 d 71.1±1.0 78.6±0.7*78.1±1.1*75.7±1.0*#△73.9±1.3*#△▲14 d 69.5±0.7 69.3±1.0 69.1±0.8 68.9±1.4 69.2±1.2

2.4 大鼠不同时间点AQP4、MMP9表达结果 伤后24 h、3 d，与TBI组比较，各给药组AQP4、MMP-9表达下降，给药浓度越高，下降越明显（P＜0.05），两两比较发现，VPA低、中、高浓度组组间差异有统计学意义（P＜0.05），在7 d、14 d，各组间AQP4差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3，图1。

伤后 4 h、3 d，各组大鼠脑组织 AQP4、MMP-9表达免疫组化显示，阳性细胞细胞质呈深棕黄色，TBI组见大量阳性表达细胞数，细胞质棕黄色深染，箭头为目标染色所在，随着给药剂量增加，阳性表达细胞数下降，细胞质棕黄色变浅。见图2、图3。

表3 不同时间点各组大鼠AQP4及MMP-9表达比较（xˉ±s,n=5）Table 3 Expressions of MMP-9 and AQP-4 proteins in the brain tissue of different groups of rats at different time points（xˉ±s,n=5）

图1 不同时间点Western blot法检测各组大鼠AQP4、MMP9的表达Figure 1 Expressions of MMP-9 and AQP-4 proteins in the brain tissue of different groups of rats at different time points

图2 镜下观察大鼠各组不同时间点AQP4表达（IHC×200）Figure 2 Expression of AQP-4 in the brain tissue of different groups of rats at different time points（IHC ×200）

图3 镜下观察大鼠各组不同时间点MMP9表达（IHC×200）Figure 3 MMP9 expression in different groups of rats at different time points（IHC ×200）

3 讨 论

急性颅脑损伤后产生很多继发性脑损伤，其中脑水肿对患者预后最为重要，其中很多因子证明参与脑水肿的形成。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族，主要由巨噬细胞、结缔组织细胞和肿瘤细胞生成，主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡，在保持血脑屏障完整性中发挥着重要作用［8］。研究表明，在TBI、脑出血、脑卒中后MMP-9表达增加，导致血脑屏障破坏，加重了脑水肿［9-11］。AQP4是在中枢神经系统中的主要水通道，在脑毛细血管星形胶质细胞足突和脑室室周上皮中表达，并通过调节胞外空间来维持脑细胞渗透稳态，具有重要的生理功能［12］，降低AQP4表达可以降低脑组织含水量，减轻星形胶质细胞肿胀和减小挫伤体积，具有脑保护作用［13］。因此，本研究试图通过VPA作用于大鼠颅脑损伤模型后，检测AQP4、MMP-9表达量，可初步判断VPA是否可以通过抑制AQP4、MMP-9表达，具有减轻脑水肿作用。

VPA为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以抑制HDAC活性，影响基因转录，使一些TBI后引起凋亡、坏死、炎症改变的基因明显下调表达而发挥脑保护作用［14-15］。本研究初步显示，AQP4、MMP-9在伤后表达增加，与张烨等［16］、李小林等［17］研究相一致，但伤后7d各组均未见阳性MMP-9表达，推测可能和脑损伤严重程度较轻有关。本研究显示，VPA可以降低AQP4、MMP-9在脑挫伤组织中高峰期的表达，减轻脑水肿，具有脑保护作用。

本实验在低剂量、中剂量及高剂量VPA作用于大鼠创伤性脑损伤模型中，通过Western blot及免疫组化观察到，高剂量组对MMP-9、AQP4蛋白表达抑制作用更为明显，与之对应的脑水肿和mNSS评分更低。虽然小剂量组对大鼠创伤性脑损伤模型脑组织中MMP-9、AQP4蛋白表达有一定抑制作用，但在减轻脑水肿及降低mNSS评分方面不具有统计学差异，显示小剂量组对大鼠创伤性脑损伤模型不具有脑保护作用，这与Brunn等［18］的正常治疗剂量VPA对体外胎儿神经干细胞无神经保护作用观点不谋而合，推测可能与小剂量VPA所引起的MMP-9、AQP4下降程度不足以影响TBI后脑水肿及mNSS评分有关，而高剂量VPA在减轻脑水肿及降低mNSS评分方面有明显优势。但过高剂量VPA具有明显毒副作用，研究显示，给予400 mg/kg连续灌胃1周，所有受试大鼠均死亡［19］。

综上所述，VPA在大鼠创伤性颅脑损伤模型中具有神经保护作用，可能与VPA抑制大鼠脑损伤组织中AQP4、MMP-9蛋白表达，减轻脑水肿有关，而大剂量VPA在减轻大鼠脑损伤模型脑水肿作用中更有优势。但具体机制及作用于人体的剂量需进一步研究。