miR-19a-3p靶向调控CCND1基因介导FrA-1/IL-6/Stat3信号通路对乳腺癌侵袭转移的作用机制

陈秀迎，王洪远

乳腺癌主要诱发因素为恶变内皮细胞增殖失控和癌细胞转移[1]。既往研究已对microRNA展开深入研究，证实其既可发挥促癌作用亦存在抑癌作用[2]，且部分microRNA可同时兼具以上两种作用[3]，在调节癌细胞生物学特性上具有显著影响，因而在临床诊断和肿瘤预测以及靶向治疗方向作用明显。大量研究已报道microRNA参与诸如头颈部、消化道、泌尿生殖系统肿瘤等[4-6]，但其分子机制仍未全可知。miR-19a-3p作为抑癌基因，在前列腺癌、胃癌等中有相关报道[7，8]。同时，细胞周期蛋白CCND1在非小细胞肺癌、乳腺癌中为阳性表达[9，10]。鉴于此，本研究通过采集组织样本和培养细胞系，基于与乳腺癌相关靶基因和信号通路的预测，探究miR-19a-3p靶向CCND1基因介导FrA-1/IL-6/Stat3通路对乳腺癌上皮间质转化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集日照市妇幼保健院病理科2017-01至2018-07女性乳腺癌标本60例。年龄28～76岁，中位年龄56.2岁。所有样本经医院伦理委员会批准通过。标本离体后，一部分立即放入液氮冷冻，-80 ℃超低温冰箱贮存备用；另一部分固定于1%中性甲醛溶液中，常规石蜡包埋，4 μm厚切片，保存备用。采用苏木精伊红染色法(HE染色)观察乳腺癌组织及癌旁组织的病理学变化。

1.1.2 细胞及培养 选取人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞株MCF7，均购自上海中科院细胞所。人乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞株MCF7均用含10%小牛血清、10 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培养液(Gibco公司，USA)培养。常规培养过程中观察细胞生长状态，并依据实际情况进行换液操作。

1.1.3 人乳腺癌细胞转染及分组 细胞处于对数期时，采用胰蛋白酶消化细胞常规培养，按转染物不同分为：空白组(空白处理)、阴性对照组(阴性质粒)、siRNA-CCND1组(siRNA)、miR-19a-3p mimic组(mimic质粒)、miR-19a-3p mimic+ siRNA-CCND1组(共转染)。转染物miR-19a-3p mimic， siRNA-CCND1质粒均购自上海吉玛公司。

1.2 方法

1.2.1 生物学数据库检索乳腺癌相关基因及信号通路 通过生物学数据库检索得到乳腺癌相关基因及相关代谢通路，分别确定为CCND1基因和FrA-1/IL-6/Stat3通路。在TargetScan数据库检索CCND1的调控miRNA为miR-19a-3p。

1.2.2 qRT-PCR检测 取乳腺癌组织和癌旁组织，加TRIzol(Invitrogen公司，USA)经3000 r/min,离心10 min,取上清,提取总RNA；采用紫外光检测RNA纯度后将抽提的RNA进行反转录；反转录所得cDNA为PCR实验模板，对目的基因进行定量PCR扩增；实时荧光定量PCR应用AB7300型实时定量PCR仪器(购于上海艾研生物科技有限公司，上海，中国)。本实验以GAPDH作为内参照基因。PCR扩增完成后，通过比较Ct法统计实验结果，此方法同样适用于细胞实验。

1.2.3 Western Blot检测 待测组织加入冰上预冷的组织裂解液，置于冰上进行裂解；Bradford法测定蛋白浓度；实验采用一抗为兔多克隆抗体CCND1、β-catenin、FrA-1；已标记二抗。Western blot所用抗体均购于abcam公司(剑桥，英国)。采用增强化学发光法检测蛋白表达(ECL试剂盒；购于武汉博士德生物技术公司)。此方法同样适用细胞蛋白表达水平检测。

1.2.4 MTT实验 按MTT常规操作程序，取对数生长期的细胞进行转染和培养(培养观察时间点为24 、48、96 h)，并依次加入各培养液继续培养；并在培养结束前加入20 μl MTT溶液(Sigma公司，USA)，继续培养4 h后弃上清并加入160 μl DMSO(Sigma公司，USA)。应用全自动酶标仪(济南正荣医疗器械有限公司)测定各孔波长490 nm处的吸光值(OD值)。

1.2.5 细胞迁移和侵袭实验 按划痕实验常规操作程序，取合适细胞株制备单细胞悬液，接种操作置于CO2培养箱(扬州恒都电子科技有限公司)常规培养24 h。之后应用高压灭菌枪头在贴壁细胞培养板孔板中心轴处划痕。继续培养，采用倒置显微镜(重庆光学仪器厂)观察细胞情况并计算细胞相对迁移率。按Transwell侵袭实验常规操作程序，分别于小室加入相应实验液，37 ℃下培养24 h、离心及结晶紫染色，显微镜下观察并在实验后期进行贴壁细胞的计数。

2 结 果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织HE染色结果 乳腺癌癌旁正常结缔组织较多，成纤维细胞増生，纤维间质稍有增生，但细胞无明显异型性，分化较好；乳腺癌组织细胞排列混乱，癌细胞大量増生，癌巢中央可见大小各异的坏死、淋巴细胞浸润，细胞发生分化，核深染，核分裂象增多，有明显核仁(图1)。

图1 乳腺癌组织及癌旁组织病理结果(HE，×100)

2.2 人乳腺癌组织和癌旁组织中FrA-1/IL-6/Stat3通路相关基因mRNA和蛋白表达水平 qRT-PCR和Western blot检测结果显示，人乳腺癌组织中CCND1、FrA-1的mRNA和蛋白表达均呈高表达，其表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)；而qRT-PCR提示人乳腺癌组织中miR-19a-3p表达水平显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 人乳腺癌组织和癌旁组织中相关基因mRNA和蛋白表达水平差异

2.3 各组细胞转染后相关基因的mRNA和蛋白表达水平 qRT-PCR和Western blot检测结果显示，空白组与阴性对照组差异无统计学意义。与空白组和阴性对照组相比，另外3组的miR-19a-3p、CCND1、FrA-1表达水平均上调，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1组中上调更为明显，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 乳腺癌各组细胞转染后相关基因的mRNA和蛋白表达水平差异

2.4 miR-19a-3p靶向CCND1对乳腺癌细胞增殖的影响 MTT法观察结果显示，各组细胞在24 h时无明显差异。48 h和96 h各组细胞增殖能力均提高。空白组与阴性对照组细胞增殖能力相比无明显差异。另外三组的细胞增殖能力均明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)，但miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1组中细胞增殖变化趋势较弱，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.5 miR-19a-3p靶向CCND1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响 空白组与阴性对照组细胞迁移、侵袭能力差异无统计学意义。与空白组和阴性对照组相比，另外三组细胞迁移、侵袭能力均减弱，差异有统计学意义(P<0.05)，且miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组迁移、侵袭能力最弱，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。

表3 miR-19a-3p靶向CCND1对乳腺癌各组细胞增殖能力变化的影响

表4 miR-19a-3p靶向CCND1对乳腺癌各组细胞迁移和侵袭能力变化的影响

3 讨 论

Kong等[11]发现，miR-27a可通过负向调控SFRP1基因，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进乳腺癌细胞增殖迁移等。Imani S等[12]亦报道miR-34a靶向EMT-TFs，抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。本研究选取高度保守microRNA，miR-19a-3p首先推断其可能具有抑制癌细胞转移的功能。根据前期临床标本的PCR和Western blot证明了我们的初步假设；同时，CCND1基因是近年来已确认的癌基因，与人类肿瘤关系密切[13，14]，且已证实在乳腺癌中异常表达[15]。为进一步确认其上下游作用机制，本研究通过人体组织样本和细胞系培养实验，发现miR-19a-3p乳腺癌中表达下降，CCND1和Fra-1表达则呈上升趋势；进一步细胞实验验证上升miR-19a-3p可有效抑制CCND1表达和Fra-1表达，抑制乳腺癌细胞侵袭转移。本研究结果这一关联机制的发现，提示miR-19a-3p可能通过靶向抑制CCND1，调控FrA-1/IL-6/Stat3信号通路，抑制FrA-1/IL-6/Stat3通路激活，伴随体外乳腺癌细胞实验中侵袭转移能力的下降，从肿瘤微环境上影响癌细胞发展进程。文献[16]发现下调miR-19a-3p有助于通过激活TGF-β信号促进前列腺癌细胞的侵袭、迁移和骨转移；张智勇等[8]发现miR-19a-3p可下降SEMA4C表达从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭。类似研究进一步支持本文假设推理，有助于通过癌细胞转染探究乳腺癌侵袭转移分子机制，为乳腺癌分子靶向治疗提供潜在实验依据。

FrA-1/IL-6/Stat3信号通路是影响肿瘤相关巨噬细胞表型的主要通路之一，后者在肿瘤微环境中有巨大的潜能[17，18]。巨噬细胞具有极强的异质性和可塑性。在恶性竞争的肿瘤微环境中，巨噬细胞可形成其独特表型，从而发挥促癌作用。本研究通过质粒转染，以miR-19a-3p表达上升，抑制FrA-1表达。FrA-1已证实是一类原癌基因，在包括乳腺癌在内的众多癌症中异常表达[19]。提示其可作为乳腺癌靶向治疗的重要靶点。我们推测FrA-1表达沉默可能进一步抑制巨噬细胞表型，干扰血管新生的形成，抑制下有信号通路，从而逆转肿瘤细胞增殖等行为的改变。

总之，本研究创新之处在于通过借助生物信息学技术和分子生物学方法，寻找潜在癌症相关靶点，确认miR-19a-3p可抑制CCND1基因表达和FrA-1/IL-6/Stat3通路激活，降低乳腺癌细胞侵袭转移。下一步研究可借助生物信息学技术，系统筛选其他与乳腺癌相关的信号通路和靶基因，并通过体内外研究及动物实验探究靶基因相关众多microRNAs的作用和功能，从而为乳腺癌靶向治疗提供全面的分子生物学证据。