食管癌120例microRNA-24表达与放疗敏感性的相关性分析

朱 勇，候 婧，鲁正学，吴 兰，李 灿

食管癌是消化道上皮组织源性恶性肿瘤，早期缺乏特异性症状，多数确诊已处于中晚期，症状以进行性吞咽困难为主。食管癌预后差，其5年生存率仅为30%[1]。放射疗法是食管癌的重要治疗手段，有研究表明不同患者对放疗的抵抗性不同，疗效存在显著差异[2]。寻找敏感、特异的分子标志物对食管癌放疗效果进行预测对制定个体化方案有重要临床意义。已有报道指出microRNA(miRNA)可作为癌基因或抑癌基因，与肿瘤进程有明显关联[3]。笔者对120例食管癌患者放疗敏感性及相关性进行分析对比，旨在为临床治疗提供借鉴。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2017-05至2018-08我院放疗科收治的120例食管癌患者，均为中晚期肿瘤患者，其中男75例，女45例，年龄60～78岁，平均(68.2±6.4)岁；鳞癌108例，腺癌12例，排除肝肾功能异常、免疫缺陷和其他恶性肿瘤等，均自愿接受放射治疗，并同意本次研究。

1.2 放疗方法 放射治疗采用三维适形放疗，模拟CT下勾画靶区，临床靶体积外0.5 cm为计划靶体积，采用6MV-X照射治疗，总剂量为60～70 Gy,1次/d，5d/周，连续治疗6～7周。放射过程中出现放射性食管炎给予对症治疗。

1.3 检测方法 放疗前收集上述患者血清作为标本。空腹抽取外周静脉血5 ml入不加抗凝剂的采血管中，标本室温静置30 min后，于2 h内以2000 r/min离心10 min，将2 ml血清移至EP管中，编号密封于-80 ℃冰箱中保存为后续PCR实验准备。

1.3.1 试剂和仪器 主要试剂：Trizol(美国Invitrogen)；All-in-OneTMmi RNA q RT-PCR Detection kit(美国 Gene Copoeia 公司)；DEPC 水(上海生工)；氯仿(中国国药集团)；异丙醇(中国国药集团)；无水乙醇(中国国药集团)等。主要仪器：实时荧光 PCR 仪 CFX96(美国 Bio-Rad 公司)；高速低温离心机(德国 Eppendorf 公司)；移液器(德国 Eppendorf 公司)；干浴恒温器(其林贝尔)；-80 ℃冰箱(美国Thermo)。

1.3.2 PCR实验步骤 trizol法提取血清总RNA；实时荧光定量PCR两步法反应体系，设计miR-24引物，然后使用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，配制实时荧光定量PCR反应体系，设置反应程序(95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s)，利用PCR仪自带软件进行分析，获得并计算血清miR-24的Ct值。

1.4 疗效标准 采用实体瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors ,RECIST)进行评价。(1)完全缓解：所有病灶消失；(2)部分缓解：基线病灶长径总和缩小≥30%；(3)稳定：基线病灶长径综合缩小<30%，或增加<20%；(4)进展：基线病灶长径总和≥20%，或出现新病灶。将稳定和进展的患者视为放疗抵抗组，将完全缓解和部分缓解视为放疗敏感组。

1.6 结果

1.6.1 放疗敏感性分组结果 依据实体瘤疗效评价标准分组，120例中放疗敏感组68例(完全缓解6例，部分缓解62例)，占56.67%，放疗抵抗组52例(25例稳定，27例进展)，占43.33%。

1.6.2 两组miR-24水平比较 实时荧光定量检测结果提示：放疗抵抗组放疗前血清miR-24的Ct值高于放疗敏感组，差异具有统计学意义(P<0.05)；放疗后放疗抵抗组血清miR-24的Ct值明显高于放疗敏感组，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 两组食管癌患者放疗前后的血清miR-24的Ct值比较

2 讨 论

放疗是通过电离辐射产生自由基从而对癌细胞进行杀伤的一种治疗方法，国内外研究认为miRNA参与到了癌细胞细胞损伤当中，可能作为放疗的生物标志物[4,5]。miRNA表达水平可能同肿瘤细胞的辐射剂量、辐照时间等有关，然后作用到靶基因，对下游蛋白进行调节。有研究对食管癌患者进行基因芯片分析，发现microRNA-296、microRNA-145、microRNA-17、microRNA-24等微小RNA均参与到DNA损伤修复中[6]。在肿瘤细胞中，通过miRNA水平改变调控细胞周期。

miRNA成为预测食管癌放疗化疗疗效和预后判断的标志物，也可能成为治疗靶点[7-9]。Ct值是反映基因拷贝数的指标，Ct值越高，基因拷贝数越低[10]，本文对我院放疗科收治的120例食管癌患者的血清miRNA进行分析发现，放疗抵抗组放疗前后血清miR-24的Ct值均明显高于放疗敏感组，说明放疗抵抗组中的miR-24表达量较少，反之miR-24表达量越多的患者，对放射治疗的敏感性可能就越好，治疗效果可能就更佳。与文献[11]研究发现miR-24通过作用于SP1能够增强鼻咽癌的放疗敏感性，结果基本一致。但食管癌患者存在放疗差异性，具有不同程度的不良反应，因此在放疗前通过检测miR-24的表达预测放疗疗效，有助于食管癌放疗的个体化治疗。

总之，miR-24的低表达可能与食管癌放疗抵抗有关，下一步我们将继续研究miR-24调节H2AX的信号通路机制，为miR-24预测食管癌放疗效果并制定个体化方案提供证据。