响应面法优化郫县豆瓣游离氨基酸的提取工艺及呈味特性分析

林洪斌,方佳兴,毕小朋,于筱雨,何 强,刘 平,丁文武,车振明

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039; 2.四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065)

郫县豆瓣起源于四川郫县,历史悠久,主要原料由二荆条辣椒、蚕豆、小麦粉和盐组成,色泽红润,酱香味浓郁[1-2],是川菜中重要的调味料,被誉为“川菜之魂”[3]。作为一种极具地方特色的发酵型调味品,其特殊的发酵工艺、原料及环境因素造就了郫县豆瓣独特的风味品质[4],同时为探明其风味形成机理带来了困难。目前国内对郫县豆瓣的风味研究主要集中在香气成分分析[5-6],而郫县豆瓣呈味物质方面的研究较为缺乏。氨基酸作为郫县豆瓣中一类重要的呈味物质,主要来源于蛋白的水解和微生物代谢[7],能够呈现酸、甜、鲜、咸等多种味道,使郫县豆瓣鲜味柔和,并增进色泽,调和香气,从而成为评价郫县豆瓣品质的重要因素之一[8]。

超声波提取是利用超声波的空穴效应及机械效应,破碎原料的细胞壁,从而加速有效成分的溶出和扩散,具有提取时间短、效率高、成本低等优点[9]。董晓菲等[10]利用超声波优化太子参总氨基酸提取工艺,得率达到11.20 mg/g,但郫县豆瓣中氨基酸提取工艺的研究较少,更是鲜有文献对郫县豆瓣中氨基酸的呈味特性进行分析,武俊瑞等[11]发现不同地区传统发酵豆豉游离氨基酸具有明显差异,索化夷等[12]研究表明豆豉氨基酸中鲜味氨基酸占比较大,鲜味突出。

本文采取响应曲面法优化郫县豆瓣呈味游离氨基酸超声提取工艺,并比较6种郫县豆瓣中氨基酸含量及对呈味贡献作用,以期为郫县豆瓣呈味机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丹丹、鹃城、川老汇、川骄、川郫、旺丰牌一级郫县豆瓣 西华大学西门世纪百盛超市;色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸 纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司;柠檬酸锂(四水)、氯化锂、柠檬酸、氢氧化锂、氢氧化钠、硼氢化钠、无水乙酸钠、茚三酮、无水乙醇、硫代双乙醇、聚氧乙烯月桂醚、辛酸、苯甲酸、乙二醇甲醚、冰乙酸 分析纯,成都科龙化工厂;氮气 纯度≥99.999%,成都昕源化工有限公司。

KH3200E超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;BSA224S分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;TDZ5-WS离心机 上海卢湘仪器有限公司;DK-99-Ⅱ电子万用电炉 天津市泰斯特仪器有限公司;MVS-1旋涡混合器 北京金紫光科技发展有限公司;日立L-8900型全自动氨基酸分析仪 日立高新技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水浸提游离氨基酸的工艺流程 郫县豆瓣样品→研磨→加水旋涡震荡→超声浸提→离心→待测液

准确称量各品牌豆瓣2 g置于研钵研磨至粉碎,按照单因素实验要求以一定液料比加入纯水混匀,漩涡震荡1 min,在一定温度下,恒定超声功率300 W超声浸提一定时间取出,3500 r/min离心20 min,取上清液为待测液。

1.2.2 单因素实验 参考已有文献,超声功率对氨基酸得率影响较小[10],且超声功率增大至空化效应饱和后,继续增加超声功率只会加强超声波的散射和衰减,不利于空化[13],综合考虑,选定超声功率300 W,并选择液料比、超声温度、超声时间3个对游离氨基酸提取有较大影响的因素进行单因素实验[14-15]。

1.2.2.1 液料比对郫县豆瓣氨基酸提取量的影响 固定超声功率300 W,超声温度35 ℃,超声时间30 min,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g))对游离氨基酸提取量的影响。

1.2.2.2 超声温度对郫县豆瓣氨基酸提取量的影响 固定超声功率300 W,液料比20∶1 (mL/g),超声时间30 min,考察超声温度(20、25、30、35、40、45 ℃)对游离氨基酸提取量的影响。

1.2.2.3 超声时间对郫县豆瓣氨基酸提取量的影响 固定超声功率300 W,液料比20∶1 (mL/g),超声温度35 ℃,考察超声时间(20、25、30、35、40 min)对游离氨基酸提取量的影响。

1.2.3 响应面试验 在单因素实验结果的基础上,采用中心组合试验设计响应面试验来优化游离氨基酸提取工艺。

表1 响应面分析因素水平Table 1 Factors and levels used for response surface analysis

1.2.4 氨基酸提取量的测定 基于茚三酮与氨基酸反应生成蓝色物质原理,对游离氨基酸提取量进行测定[16]。

称取干燥至恒重色氨酸标准品加水分别配制成浓度梯度为0.025、0.0375、0.05、0.0625、0.075、0.0875、0.1 mg/mL的溶液,分别取上述溶液1 mL加入pH6.5的CH3COONa缓冲溶液和2%茚三酮溶液各1.0 mL,摇匀,置于沸水浴中加热40 min,取出并冷却15 min,以纯水溶液为空白对照,于570 nm处测定吸光值A,绘制标准曲线,标准曲线公式如下:

Y=25.126X-0.1772,R2=0.999

式中：Y为吸光度值;X为色氨酸浓度(mg/mL)。

依据标准曲线,取待测液测定郫县豆瓣氨基酸质量浓度,依据下述公式计算游离氨基酸提取量:

式中：m为根据标准曲线算得氨基酸含量(mg/mL);V为待测液体积(mL);W为称取样品质量(g)。

1.2.5 氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸组成 标准溶液的制备:根据国标GB/T 30987-2014中标准溶液的配制,配制20种游离氨基酸浓度为1.25 μmol/mL作为母液。

流动相的配制:根据国标GB/T 30987-2014中相关要求配制流动相B1-6及R1-3。

样品的制备:将待测液于4 ℃下1000 r/min离心15 min,取上层清液过0.22 μm微孔滤膜后,上机测定。

色谱条件:色谱柱日立生理体液分析柱PF(3 μm,1.6 mm×60 mm);反应柱温度135 ℃;流动相流速为0.35 mL/min,反应液流速为0.30 mL/min;分离梯度条件及反应液梯度条件见GB/T 30987-2014,检测器检测波长为570和440 nm。

1.2.6 郫县豆瓣游离氨基酸呈味分析 滋味物质的味道强度值(Taste activity value,TAV)指样品中滋味物质的绝对浓度与该滋味物质的呈味阈值之比,通常用来评价单个滋味物质对食品滋味的贡献大小,TAV是一种客观的评价方式,已广泛用于食品风味研究[17],本文中计算公式如下:

式中：C为氨基酸自动分析仪测得游离氨基酸浓度,mg/g;T为氨基酸呈味阈值,mg/g。

1.2.7 郫县豆瓣定量描述滋味感官分析法 采用10点制定量描述滋味感官分析法对郫县豆瓣感官属性进行评价。感官评定小组由二十人组成,十五名女性、五名男性,年龄在20～30岁之间,并根据GB/T-2012-16291.1对二十位感官评定小组成员进行培训。经过预实验及商量讨论后,确定味道参考标准如下:酸(柠檬酸0.03%)、甜(葡萄糖1%)、苦(硫酸奎宁0.9%)、咸(食盐1%)以及鲜(谷氨酸钠0.2%)。样品进行随机编码,品尝杯内为0.05 g/mL的样品水溶液20 mL,每个样品重复评价3次。

1.3 数据处理与统计分析方法

采用Design-Expert v 8.0.6软件进行响应面中心组合试验设计,采用SPSS 17.0软件对数据进行整理统计分析,各项指标结果以“平均数(n=5)±标准偏差”表示,采用S-N-K法进行差异显著性分析(P<0.05),图表中标注不同字母的数据表示数据间具有显著性差异;采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对游离氨基酸提取量的影响 由图1可知,游离氨基酸提取量随液料比的增加,呈现先增加后减少的趋势,液料比为25∶1 (mL/g)时游离氨基酸提取量达到最大值。一般来说,随着样品中溶剂比例升高,提取率也会增加,但当溶剂比例增加到一定比例时,溶剂趋于饱和,此时再增加液料比,不但不会增加游离氨基酸的提取,反而可能使其他水溶性物质溶出增加,阻碍游离氨基酸的提取。因此考虑游离氨基酸提取率,选择20∶1～30∶1 mL/g的液料比作为进一步优化的范围。

图1 液料比对游离氨基酸提取量的影响Fig.1 Effect of liquid material ratio on extraction of free amino acids

2.1.2 超声温度对游离氨基酸提取量的影响 由图2可知,游离氨基酸提取量随超声温度的增加,呈现先缓慢增加后减少的趋势。超声温度的适当提高可以增加分子扩散速度,有助于提高提取效率,因此在一定范围内,提取量会随超声提取温度增加而增加,在30 ℃左右达到最大值;而超过35 ℃后,提取率反而明显下降。综上,选择30～40 ℃的超声温度作为进一步优化的范围。

图2 超声温度对氨基酸提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction of free amino acids

2.1.3 超声时间对游离氨基酸提取量的影响 由图3可知,随着超声时间的延长,游离氨基酸提取量呈现先上升然后趋于稳定的趋势,在25 min左右时达到最大值,说明原料与溶剂充分接触,传质达到饱和,且氨基酸分子质量较小,已大部分溶出,继续延长超声时间,不会对其浸提量有太大影响,反而可能会引起氨基酸分子结构的变化,影响提取率[18]。综合考虑选择超声时间25～35 min作为进一步优化的范围。

图3 超声时间对氨基酸提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of free amino acids

2.2 响应面试验设计与结果

以液料比、超声温度和超声时间3个实验因素,根据单因素实验结果选定因素水平,以游离氨基酸提取量为响应值,采用中心组合试验设计响应面试验来优化游离氨基酸提取工艺,结果见表2,试验结果用Design-Expert进行分析。

2.3 模型的建立、显著性检验及响应面图分析

对表2中的试验数据进行多元二次多项式回归拟合,得到的四元二次回归方程为:

W=18.31+2.86A-0.19B-0.44C-0.38AB-0.035AC-0.087BC-3.97A2-2.12B2-2.24C2

由表3可知,模型P=0.0007,方程模型达到极显著,失拟项P=0.0693>0.05不显著,表明使用该方程预测郫县豆瓣氨基酸提取工艺是可行的;决定系数R2=0.9529,说明该模型与实际情况接近,即试验误差小,能充分反映出各因素之间的关系,因此,可以用该方程对实验结果进行分析。由方差分析可知,因素A、A2、B2、C2影响极显著(P<0.01),各因素影响程度依次为液料比>超声时间>超声温度,模型中二次项系数均为负数,表明该模型抛物面开口向下,有极大值点,即游离氨基酸最优提取点。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation

经Design-Expert软件对实验结果进行分析,做出响应面的3D和等高线分析图,反映各因素在提取过程中对响应值的影响,结果见图4。

图4 各因素交互作用对游离氨基酸提取量影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plot for the effects of free amino acids extraction

由图4可知,氨基酸提取率随液料比、超声温度及超声时间的增大而增大,达到各因素中心值后随各因素增大而减小。液料比坡面较提取时间和提取温度坡面更陡,且沿液料比轴向等高线更密集,说明液料比对氨基酸提取量影响显著,与方差分析结果一致,所以控制液料比对提高游离氨基酸提取量至关重要。从图4中也可看出各等高线椭圆形状不明显,说明各因素交互作用不明显。

本实验经优化得到最佳的提取条件为液料比为26.82∶1 (mL/g),超声温度34.61 ℃,超声时间29.51 min,预测游离氨基酸提取量为18.86 mg/g,考虑到实际操作的局限性,将提取工艺条件中液料比修改为27∶1 mL/g,超声温度35 ℃,超声时间30 min,在此条件下,重复时间5次,郫县豆瓣酱中游离氨基酸的提取量为18.51 mg/g,与模型预测性相对误差为1.86%,证实了该方程的准确性和实用性。

2.4 游离氨基酸定性及定量分析及呈味分析

郫县豆瓣样品中氨基酸组成由氨基酸自动分析仪测定。通过与标准色谱图比较,分别定性和定量测定六种样品的氨基酸含量,结果见图5。同时参考Park等[19]对不同呈味氨基酸的分类方式,将氨基酸分为五类,即甜鲜味、鲜酸味、苦甜味、苦味和咸味氨基酸,见表4。总共分析了样品中19种游离氨基酸,包括17种氨基酸和2种酰胺类物质,结果在6种样品中均未检测到谷氨酰胺(Gln)和半胱氨酸(Cys),因此将其余17种游离氨基酸作为郫县豆瓣中的主要呈味氨基酸进行比较和分析。

表4 游离氨基酸呈味分类Table 4 The taste of free amino acids

图5 氨基酸自动分析仪色谱图Fig.5 Amino acid automatic analyzer chromatograms

氨基酸不仅能增加发酵品滋味,也为后续香气物质形成提供基础,是风味的重要组成物[20]。

如表5所示,由于发酵环境、产品类型、原料来源等不同,6种郫县豆瓣样品间游离氨基酸含量均有差异,样品6中所含游离氨基酸含量最高,但呈味氨基酸组成比例却大致相同,呈鲜酸味氨基酸含量最高,4种氨基酸的总和分别达到6.460、4.000、6.430、4.940、6.240、10.201 mg/g,总量平均达6.380 mg/g,其中谷氨酸和天冬氨酸含量较高,紧随其后的是甜鲜味氨基酸,4种氨基酸的总和分别达到5.063、3.902、5.505、4.018、4.891和9.858 mg/g,总量平均值达5.540 mg/g,6种样品呈鲜味氨基酸总量平均达到11.920 mg/g,这些氨基酸在郫县豆瓣鲜味形成中起到至关重要的作用。Kim等[21]发现,大酱样品中大豆蛋白水解而得到的谷氨酸和天冬氨酸可以提供鲜酸味,中国传统发酵豆酱中，谷氨酸是最丰富的氨基酸,其次是天冬氨酸,约占30%左右,此结论和本实验结果相符[22],同时谷氨酸与盐的复合反应能提高食品鲜味[23],而郫县豆瓣含盐量在15%～22%之间,此二者可协同提高郫县豆瓣鲜味。除旺丰样品外,其次含量较高的是苦味和甜味氨基酸。根据已有研究,苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)在酱制品中提供独特的甜味[21],黄梅桂等[24]分析甜面酱中众多呈甜味氨基酸后发现丙氨酸对甜味起到了重要贡献。此外,6种样品中含有少量苦甜味氨基酸成分。

表5 郫县豆瓣样品中游离氨基酸含量分析Table 5 Analysis of free amino acids contents in Pixian board bean paste

呈味物质对呈味的贡献与其含量及阈值有密切联系,其通常认为,当TAV大于1时,该滋味物质对样品呈味有重要影响,且数值越大,影响越大,而TAV小于1时,该物质对呈味贡献不大[25]。由表6可以看到,样品中TAV皆大于1的有丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和缬氨酸,主要包括甜鲜味、鲜酸味及苦甜味氨基酸。鲜味是郫县豆瓣滋味的一个主要特征,呈鲜味的谷氨酸TAV远远高于其他氨基酸,最高的旺丰豆瓣中TAV达到14.82,且谷氨酸和呈味核苷酸间的协同作用能产生更强烈的鲜味[26],说明谷氨酸是郫县豆瓣中鲜味的主要贡献者,其次是缬氨酸和精氨酸TAV较高,其对郫县豆瓣苦味影响明显,最后是天冬氨酸、赖氨酸、丙氨酸和组氨酸。其他氨基酸TAV值大多小于1,对滋味贡献程度较小,但具有不同程度的协同作用。

表6 郫县豆瓣中氨基酸TAV分析Table 6 The TAV values of free amino acids in Pixian board bean paste

2.5 滋味感官评价结果

感官评价人员主要通过酸、甜、苦、咸、鲜五个属性对6种郫县豆瓣滋味感官特征进行描述,结果如图6所示。由于生产原料、环境等不同,6种郫县豆瓣各属性感官评价得分均有不同,从整体看,6种不同的郫县豆瓣都呈现较突出的鲜、咸口感,郫县豆瓣作为一味调味料,鲜味及咸味是评价其品质的重要指标之一。咸味属性差异主要因为生产过程中添加的盐含量不同导致,而鲜味主要来源于郫县豆瓣中的多肽及氨基酸。从图6中可以看出旺丰豆瓣样品鲜味最为突出,其鲜味属性得分最高。结合氨基酸含量及TAV看,与结果一致,旺丰豆瓣样品呈鲜味氨基酸含量及TAV值均远远高于其他样品,尤其是谷氨酸提供了主要的鲜味。而郫县豆瓣甜味主要由呈甜味氨基酸及部分低聚糖共同影响,但6种郫县豆瓣甜味属性得分较低且差别不大,其原因可能呈味还原糖在发酵过程中的降解和美拉德反应产生了消耗或者较高的鲜味抑制了甜味。同时氨基酸之间相互作用也会影响其他滋味作用的表达,例如甘氨酸在提供鲜甜味的同时也能减少苦味。

图6 郫县豆瓣滋味感官评价得分雷达图Fig.6 The taste sensory quality score radar map of Pixian board bean paste

3 结论

本研究利用响应面试验设计优化了郫县豆瓣中游离氨基酸的提取工艺,建立起多元二次优化模型。结果显示,液料比对游离氨基酸提取量影响最大,结合实际操作,最终确定游离氨基酸提取工艺条件为液料比27∶1 (mL/g),超声温度35 ℃,超声时间30 min,实际值18.51 mg/g与预测值基本相符,证明该方案的准确可行。

定性及定量分析了6种郫县豆瓣中游离氨基酸组成,研究发现郫县豆瓣中,呈鲜酸味氨基酸总量最多,主要由谷氨酸和天冬氨酸组成,其次是甜鲜味、苦味及甜味氨基酸,其中旺丰豆瓣样品各类氨基酸含量均明显高于其他样品。6种郫县豆瓣中TAV大于1的氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和缬氨酸,它们对郫县豆瓣呈味贡献作用较大,其中谷氨酸对鲜味起重要贡献作用。结合滋味感官评价,6种样品鲜、咸属性得分较高,而旺丰豆瓣样品鲜味最突出。本研究结果为下一步探究郫县豆瓣关键呈味物质奠定基础。同时很多氨基酸也是部分香味物质形成的物质基础,要系统阐明氨基酸在郫县豆瓣中呈香呈味的作用还需进一步研究。