白藜芦醇/紫胶钠盐微胶囊的响应面法优化及其释放性能

刘 鑫,邓 姣,李洁欣,周 军,李湘洲,2,*

(1.中南林业科技大学材料科学与工程学院,湖南长沙 410004; 2.南方林业生态应用技术国家工程实验室,湖南长沙 410004)

白藜芦醇作为一种具有抗氧化、抗炎、抗心血管疾病和抗肿瘤等多种功能的天然营养因子,其生理活性方面的研究已较深入,而在功能产品开发方面仍较少[1]。然而,白藜芦醇存在水溶性差、性质不稳定等天然缺陷,人体直接食用后难以被吸收利用,因此,最大限度地提高白藜芦醇的生物利用度已成为其功能食品、保健品开发的难题[2-3]。

选择性能优良的材料是产品开发的关键。天然的高分子材料种类繁多,包括多肽、多糖、蛋白等[4-6]。紫胶又名虫胶,是一种紫胶虫寄生于树枝上吸食树汁后分泌的一种紫红色天然树脂。由于紫胶树脂本身具有良好的成膜性且天然无毒、可食用,在食品,医药领域中被作为一种理想的材料而用作被膜剂和包衣材料,以实现食品的保鲜和药物缓释及靶向给药功能[7-8]。但紫胶树脂较差的水溶性以及结构上的不稳定使其在利用上受到了极大的限制[9]。

本研究主要采用碳酸钠对紫胶树脂中的羧基进行化学改性,并将制得的紫胶树脂钠盐应用于白藜芦醇的包埋,响应面法优化微胶囊的制备工艺,并对制备的微胶囊的性能进行表征,以获得具有稳定的热力学性能和pH响应性的白藜芦醇功能产品,提高人体对白藜芦醇的吸收与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

98%的白藜芦醇 花垣恒远植化有限公司;紫胶树脂 产于广西;吐温80、乙醇、乙酸乙酯、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠 优级纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

AUY120分析天平 最小分度0.0001 g,日本岛津公司;HH-S1型恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂;101-1AB型电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;DF-1集热式恒温磁力搅拌器 常州市江南实验仪器厂;KM-700VDV-3超声波清洗器 昆山美美超声仪器有限公司;SCIENTZ-18N冷冻干燥仪 宁波新芝;RC-3溶出度测试仪 天津市光学仪器厂;B-290喷雾干燥仪 步琦实验室设备贸易有限公司;ALPHA傅立叶红外光谱分析仪 BRUKER公司;TU1901紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DSC-8500差示扫描量热仪和TGA-8000热重分析仪 美国Perkin Elmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇标准曲线的绘制 配制溶液浓度分别为1.2、2.4、3.6、4.8和6.0 mg/L的白藜芦醇-乙酸乙酯标准溶液,以乙酸乙酯为参比,在波长305 nm处分别测定各浓度溶液的吸光度,得到标准曲线y=127.53x+0.0035,R2=0.9994(Res浓度为1.2～6.0 mg/L)。同理得到Res在pH=1.0条件下的标准曲线为y=133.04x-0.0146,R2=0.9994(Res浓度为8.0～160 mg/L);pH=6.8条件下的标准曲线为y=100.18x-0.0024,R2=0.9999(Res浓度为8.0～160 mg/L)。

1.2.2 紫胶树脂钠盐的制备 配制浓度为0.1 mol/L的碳酸钠溶液,在60 ℃下,取200 mL碳酸钠溶液溶解12～14 g的紫胶树脂,制备成SSC的饱和溶液,分装于表面皿中,冷冻干燥后得到SSC,研磨后备用[10]。

1.2.3 SSC/Res微胶囊的制备 称取一定量的紫胶树脂钠盐(壁材),溶于水,加入既定的Res(芯材)及乳化剂Tween 80,50 ℃恒温水浴下磁力搅拌1 h,得到初乳液[11-12],在设定的进料流量和进口温度下,对初乳液进行喷雾干燥,收集微胶囊产品,测定其Res的包埋率和载药量。

1.2.4 单因素实验 按照1.2.3中所述方法,以微胶囊中Res包埋率及载药量为指标,单因素考察壁材(SSC)与芯材(Res)比、喷雾干燥进口温度、进料流量对微胶囊中Res的包埋效果。其中考察壁-芯比分别为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1和7∶1 (g/g)时,其它条件为Res和吐温80加入量均为0.5 g、进口温度140 ℃、进料流量10 mL/min;考察进口温度分别为140、150、160、170 ℃时,其它条件为壁-芯比4∶1 (g/g)、吐温80加入量为0.5 g、进料流量10 mL/min;考察进料速量分别为8、10、12、14 mL/min时,其它条件为壁-芯比4∶1 (g/g)、吐温80加入量0.5 g、进口温度140 ℃。

1.2.5 响应面设计实验 在单因素实验的基础上,以微胶囊中Res的载药量为指标,选择壁-芯比、进口温度和进料流量为考察因素,设计了三因素三水平的响应面试验,因素水平表见表1。

表1 响应面设计的因素水平编码表Table 1 Factors and levelsTable of response surface design

1.2.6 SSC/Res微胶囊中Res包埋率、载药量的测定 取50 mg微胶囊产品于离心管中,加入5 mL乙酸乙酯,清洗并溶解微胶囊表面的白藜芦醇,高速离心后取上清液1 mL于50 mL的容量瓶中,用乙酸乙酯定容,紫外光谱305 nm处测定其吸光度,代入标准曲线计算得到微胶囊表面白藜芦醇含量。Res包埋率和载药量的计算按式1和式2进行[13]。

式(1)

式(2)

其中:m0为微胶囊中Res的理论投料量;m1为微胶囊表面的Res含量;m为微胶囊用量。

1.2.7 扫描电镜(SEM)分析 取适量粉末状的白藜芦醇、紫胶树脂钠盐以及SSC/Res微胶囊粘在有导电胶的样品台上,在真空镀膜机中喷金,然后用扫描电镜不同观察样品的表观形貌。

1.2.8 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析 取少量的Res、紫胶树脂、SSC以及SSC/Res微胶囊进行红外光谱扫描,分别与干燥的KBr进行混合,研磨、压片。在红外光谱下扫描,扫描频率64 Hz,扫描32次,扫描范围400～4000 cm-1。

1.2.9 热重-差式扫描量热(TG-DSC)分析 分别取少量的RES、SSC以及SSC/Res微胶囊至铝制小坩埚中,封压后放入DSC测量仪中。测量的温度范围在30～400 ℃,升温速率为10 ℃/min。使用液氮为降温物质,加热过程中均以高纯N2为吹扫气和保护气。

分别取经预处理后的RES、SSC以及SSC/Res微胶囊,进一步粉碎、筛分,选取粒径小于120目的样品进行热重分析,载体为氮气(50 mL/min),升温速度为10 ℃/min,温度起始范围为30～800 ℃。

1.2.10 体外释放效果测试 采用透析法考察SSC/Res微胶囊的体外释放行为。分别以pH为1.0和pH为6.8的PBS溶液作为释放介质,考察SSC/Res的释放性能。称取50 mg白藜芦醇粉末及含等量Res的SSC/Res微胶囊固体置于截留分子量为14000 Da的透析袋内,并将透析袋置于400 mL 的PBS释放介质中。在温度为37 ℃、转速为100 r/min的溶出度仪中进行释放实验,一定时间后取样5 mL,同时向其中补加5 mL新鲜的PBS释放介质。样液用紫外-可见分光光度计测吸光度,计算Res的累积释放率[14-15]。

1.3 数据处理

所有数据采用Origin 9.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 壁-芯比对SSC/Res微胶囊中Res包埋效果的影响 由图1可知,随着壁-芯比的增大,微胶囊中Res的包埋率呈增大的趋势,这是因为SSC壁材量的增加,对芯材的包埋能力增大,但当壁材量增大到一定量后,芯材的包埋率增加不明显;而随着SSC用量的增加,Res载药量呈快速降低的趋势,这是因为壁材的增大,溶液中的固形物总量增大,而Res的加入量不变,导致Res所占比例降低,微胶囊中Res的载药量降低。综合微胶囊中Res的包埋率和载药量,宜选择壁-芯比为3∶1～5∶1进行响应面试验。

图1 壁-芯比对微胶囊中Res包埋率(a)和载药量(b)的影响Fig.1 Effects of different wall-core ratios on embedding rate(a)and load rate(b)of Res

2.1.2 进口温度对SSC/Res微胶囊中Res包埋效果的影响 由图2可知,随着喷雾干燥进口温度的升高,微胶囊中Res的包埋率和载药量在140～150 ℃时较高,这主要是由于温度较高时微胶囊的壁材水分迅速挥发,形成固体外壳,防止了芯材的流出,但是当进口温度大于160 ℃时,Res的包埋率和载药量均明显降低,可能是由于高温下的水分蒸发速度更快,在微胶囊的壁表面产生气孔,降低了壁材的成膜性,导致包埋率和载药量均下降。而实验过程中,进口温度低于140 ℃时,喷雾干燥无法获得微胶囊。因此,宜选择进口温度为140～160 ℃进行响应面试验。

图2 不同进口温度对微胶囊中Res包埋率(a)和载药量(b)的影响Fig.2 Effect of different inlet temperatures on embedding rate(a)and load rate(b)of Res

2.1.3 进料流量对SSC/Res微胶囊中Res包埋效果的影响 由图3中可知,微胶囊中Res的包埋率和载药量均随着进料流量的增大呈现出先增大后降低的趋势。当喷雾干燥进料流量较低时,料液中的水分易于蒸发而形成干粉状的微胶囊颗粒;而当进料流量过大时,料液中较多的水分无法完全蒸发,导致微胶囊中水份含量较高,同时影响微胶囊的包埋效果。当进料流速为10 mL/min时,制备的微胶囊中Res的包埋率和载药量均为最大值。因此,宜选择进料流速为8～12 mL/min进行响应面试验。

图3 不同进料流量对微胶囊中Res包埋率(a)和载药量(b)的影响Fig.3 Effect of different feed rates on embedding rate(a)and load rate(b)of Res

2.2 响应面设计与结果分析

2.2.1 响应面试验结果 根据单因素实验结果,响应面试验设计及结果如表2。以载药量为响应值。以壁-芯比(A)、进口温度(B)、流量(C)为自变量,建立三因素三水平中心组合实验设计共包括17个实验方案。

表2 响应面试验设计及载药量Table 2 Response surface test and its results

2.2.2 回归拟合方程及方差分析 由表3可知,“Prob>F”值小于0.050表明模型的影响显著。对于失拟项拟合方程的显著性较好,拟合度R2=0.9904。通过软件进行二次回归响应分析,建立多元二次响应面回归模型,得到回归方程为:Y=15.73-2.21A+0.12B-8.750E-003C-0.31AB+0.17AC-0.26BC-0.48A2+0.61 B2-0.79C2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

对数据进行处理得到响应面模型预测的优化工艺为壁-芯比3∶1 (g/g)、进口温度160 ℃、进料流量9.45 mL/min,此条件下模型预测的微胶囊中Res最大载药量为18.56%。在3∶1、进口温度160 ℃、进料流量为9.5 mL/min条件下进行验证实验,3次验证试验的平均值为18.17%,与模型预测结果较为接近,说明应用响应面法预测制备微胶囊的工艺可靠[16]。

2.3 优化工艺下制备的SSC/Res微胶囊的性能分析

2.3.1 扫描电镜分析 由图4可知,白藜芦醇外形细长,大小不均匀,晶体结构较大可达100 μm;利用碳酸钠对紫胶树脂改性后得到的SSC为不规则的小颗粒,粒径较大;而经喷雾干燥制备的SSC/Res微胶囊为球体结构,表面光滑且无明显裂缝,囊壁的结构保持完整,粒径分布在1～8 μm,与Res和SSC相比,微胶囊的粒径明显减小。喷雾干燥技术能制备形态较好、稳定性好的SSC/Res微胶囊。

图4 样品的SEM图Fig.4 SEM analysis 注:a:白藜芦醇(500×);b:紫胶树脂钠盐(500×); c:SSC/Res微胶囊(5000×)。

2.3.2 红外光谱分析 由图5对比紫胶树脂和紫胶树脂钠盐的红外光谱图可知,紫胶树脂钠盐和紫胶树脂的红外特征吸收峰基本吻合,但改性后紫胶树脂钠盐在1713、1253、1042 cm-1及指纹图谱区的红外吸收明显减弱,而1565 cm-1处的吸收峰明显增强,这是由于羧酸成盐后形成的羧酸根负离子两个相同的C-O键发生振动耦合效应[17],说明碳酸钠对紫胶树脂的改性成功。Res红外光谱图中3220 cm-1附近为酚羟基特征吸收峰,1608、1588和1513 cm-1附近为苯环特征吸收峰[18],以紫胶树脂钠盐为壁材制成的SSC/Res微胶囊红外谱图中保留了部分紫胶树脂钠盐本身的特征吸收峰,在1513和3200 cm-1处出现了白藜芦醇的特征吸收峰,由于Res与紫胶树脂钠盐部分特征吸收峰相同,且紫胶树脂钠盐作为壁材对Res包埋后,Res的特征吸收峰大部分被掩蔽,所以制备的SSC/Res微胶囊Res特征吸收峰不太明显。

图5 红外光谱扫描对比图Fig.5 Contrast figure of FT-IR analysis注:a:Res;b:SSC/Res微胶囊;c:SSC;d:紫胶树脂。

2.3.3 TG-DSC分析 由图6可知,3组样品的热解过程大致可以分为3个阶段,包括干燥阶段、主失重阶段以及炭化阶段[19]。紫胶树脂钠盐在第一阶段的失重速率明显快于SSC/Res微胶囊和Res样品,在290 ℃之前,SSC/Res微胶囊和Res样品的热解速率基本一致,而290 ℃之后,Res样品热解进入主失重阶段,热解失重速率快速增加;SSC/Res微胶囊在350 ℃之后才进入主失重阶段,说明SSC/Res微胶囊的热稳定性优于白藜芦醇和紫胶树脂钠盐。

图6 热重分析对比图Fig.6 Contrast figure TG analysis注:a:SSC/Res微胶囊;b:紫胶树脂钠盐;c:Res。

当Res被紫胶树脂钠盐包埋后得到的SSC/Res微胶囊产品的热力学性质可能会发生一定的变化,为了进一步验证微胶囊的热稳定性,采用DSC对产品进行热力学分析。由图7可知,Res样品在270 ℃附近出现一个尖锐的吸热峰,对应为Res的玻璃化转变温度。而SSC/Res微胶囊在此处没有出现明显的吸热峰,由此证明改性后的微胶囊提高了白藜芦醇的热稳定性。

图7 DSC对比图Fig.7 Contrast figure of DSC analysis注:a:Res;b:SSC/Res微胶囊;c:紫胶树脂钠盐。

2.3.4 SSC/Res微胶囊体外释放性能 食物经人体摄入后一般需要经过口腔、胃及小肠吸收后进入人体的血液循环中,整个过程大约需要 3～16 h,而口腔一般对淀粉类具有消化功能,而对淀粉类含量低的食品可忽略不计[20]。对于理想的功能食品,应具有能够在胃部强酸性条件下(pH=1.0～2.5)保持稳定,而进入肠道(pH=5.1～7.8)后能在较短时间内(8～10 h)充分释放出功能因子,以避免功能因子的提前释放,同时有助于其在肠道内的吸收。由图8可知,在pH为1的模拟胃液条件下,4 h内,SSC/Res微胶囊中Res的释放速率明显小于Res样品;在pH为6.8的模拟肠液中,SSC/Res微胶囊中Res出现突释,至10 h后释放速率变缓,而Res样品10 h后基本释放完全。在模拟胃液中,Res的累积释放率为38%,而SSC/Res微胶囊中Res的累积释放速率仅为18%;在模拟肠液中,4～20 h内Res的累积释放率为45%,而SSC/Res微胶囊中Res的累积释放速率为60%,说明制备的SSC/Res微胶囊具有较好的pH响应性,能在模拟肠液中实现快速释放。

图8 体外释放效果Fig.8 In vitro release注:a:Res;b:SSC/Res微胶囊。

3 结论

以碳酸钠改性的紫胶树脂钠盐为壁材,利用响应面法优化了喷雾干燥制备SSC/Res微胶囊的工艺。获得优化工艺为壁-芯比3∶1 (g/g),进口温度160 ℃,进料流量9.5 mL/min,此条件下Res的载药量为18.17%,与响应面预测值接近,响应面法预测SSC/Res微胶囊的喷雾干燥制备工艺可靠。

SSC/Res微胶囊的利用SEM、FT-IR和TG-DSC分析表明:紫胶树脂钠盐对Res进行了有效的包埋,制备的微胶囊为光滑的球体结构,热力学性质稳定。SSC/Res微胶囊在模拟胃液环境下(pH=1)较稳定,Res释放量较少,而在模拟肠液环境下(pH=6.8)能实现快速释放。白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理活性,将其开发成具有肠溶特性的功能食品或保健品,有利于白藜芦醇在人体肠道内的吸收与利用。