UPLC-MS/MS测定婴幼儿配方乳粉中双酚A和壬基酚

公丕学,廉贞霞,薛 霞,卢兰香,宿书芳,王 骏,尹丽丽,刘艳明,*

(1.山东省食品药品检验研究院,山东济南 250100; 2.山东省药学科学院,山东济南 250100)

双酚A(Bisphenol A,BPA)是重要的有机化工原料,是苯酚和丙酮的重要衍生物,主要用于生产高分子材料,也可用于精细化工产品生产[1]。壬基酚(Nonylphenol,NP)是一种重要的精细化工原料和中间体,主要用于生产表面活性剂,也用于抗氧剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域[2]。BPA和NP也是倍受关注的内分泌干扰物,具有弱雌激素效应[3-4],其化学结构如图1所示,能扰乱人类和野生动物内分泌系统的正常功能,损伤再生机能，产生恶性肿瘤,从而对人类健康和野生动物构成极大的威胁[5]。BPA和NP在肉制品、乳制品、水产品等多种食物中广泛存在[6-9]。

图1 BPA、NP结构式Fig.1 Bisphenol A and nonylphenol structural formulas

目前测定BPA和NP方法的前处理主要有直接提取法[10-11]、液液萃取法[12]、凝胶渗透色谱净化法[13-15]、固相萃取净化法[16-18]、QuEchers净化法[19]等。直接提取法快速简单,液液萃取法提取效率低,凝胶渗透色谱净化法消耗有机溶剂多,处理时间长,由于固相萃取法和QuEchers净化法有塑料耗材的使用,可能会导致BPA和NP不能准确定量。BPA和NP的检验方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[20-22],液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)[23-25]以及气相色谱-质谱法(GC/MS)[26-28]。液相色谱法检测灵敏度较低,选择性和特异性差,不适合婴幼儿配方乳粉的检测;气相色谱质谱法实验中需要对目标物进行衍生化,步骤繁琐,衍生效率不稳定,准确性差;液相色谱-串联质谱法前处理过程简单,选择性好,灵敏度高,但由于流动相存在本底值直接测定影响定量,因此建立基于流动相捕集技术的超高效液相色谱-串联质谱检测方法,能够对样品中BPA和NP准确定量。

本文选择快速简单的直接提取法,先加水溶解再用乙腈提取,使用在线捕集技术,有效消除流动相本底值对测定结果的影响,考察不同提取方式对提取效率的影响,建立了婴幼儿乳粉中BPA和NP的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法线性范围宽,检出限低,提取效率高,灵敏度高,适用于婴幼儿配方乳粉中BPA和NP的定性确证与定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

婴幼儿配方乳粉 济南市某大型超市;BPA、BPA-d4、NP、NP-d8标准品 德国Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈、氨水 色谱纯,德国Merck公司。

ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH C18(1.8 μm,2.1×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH C18短色谱柱(1.8 μm,2.1×50 mm)、捕集柱:Isolator column(1.8 μm,2.1×50 mm)、Waters ACQUITY超高效液相色谱仪 美国Waters公司;AB SCIEX Triple Quad 5500三重四极杆质谱分析仪(配有电喷雾离子源ESI及MultiQuant数据处理系统) 美国SCIEX公司;MS-3型旋涡混合器 德国IKA公司;SB-800DTD型超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司;3-18k型高速冷冻离心机 德国SIGMA公司;Milli-Q型超纯水机 美国Millipore公司;N-EVAP-45型温控氮吹仪 美国Organomation公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 分别称取适量的BPA和NP标准品,用甲醇配成1 mg/mL的标准物质储备液,-18 ℃保存。将浓度为1 mg/mL同位素内标标准储备液用甲醇稀释成100 ng/mL的混合内标工作溶液。用甲醇将BPA和NP储备液稀释成浓度为1、5、10、50、100、500、1000、2000 ng/mL的标准系列溶液,其中每个浓度的标准溶液中含相同浓度5 ng/mL同位素内标,供液相色谱-串联质谱测定。

1.2.2 样品前处理方法 称取1 g(精确到0.01 g)婴幼儿配方乳粉样品到10 mL圆底玻璃刻度管,准确加入1 mL水溶解,加100 μL 100 ng/mL内标溶液,准确加9 mL乙腈涡旋混匀,超声(频率大于85%)提取15 min,3000 r/min 25 ℃离心5 min,放至-18 ℃冷冻12 h后,取出5 mL上清液至另一10 mL玻璃刻度管,45 ℃氮吹近干,用1 mL甲醇复溶,涡旋,超声(频率大于85%)5 min后,取到1.5 mL塑料离心管中,10000 r/min 25 ℃离心2 min,取清液到进样瓶中待上机。同时需要做试剂空白实验(除不加样品外相同的前处理方法)。

1.2.3 色谱条件 捕集柱:Isolator column(填料为C18,1.8 μm,2.1 mm×50 mm)。安装方式如图2所示。

图2 捕集柱连接图Fig.2 Connection diagram of isolator column

色谱柱:BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱温:40 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:5.0 μL;流动相:A:甲醇,B:0.1%氨水,梯度洗脱程序见表1所示。

表1 流动相梯度程序Table 1 Gradient program for mobile phase

1.2.4 质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM检测;Curtai Gas(CUR)20.0 L/h,Collision Gas(CAD)8 L/h,IonSprary Voltage(IS)5000 V,Temperature(TEM)500 ℃,Ion Source Gas1(GS1)50 L/h,Ion Source Gas2(GS2)50 L/h。BPA和NP及内标优化的关键质谱参数见表2所示。

表2 化合物关键质谱参数的优化Table 2 The optimized MS parameters of compounds

1.2.5 方法的线性范围和检出限 将含BPA、NP内标的标准工作溶液按质量浓度由低到高的顺序依次经超高效液相色谱-串联质谱进行分析测定,以BPA、NP标准工作溶液的质量浓度(ng/mL)为横坐标,以其对应丰度较高的定量离子标准溶液响应峰面积与内标溶液的响应峰面积之比为纵坐标,绘制目标化合物标准工作曲线。

1.2.6 方法的回收率和精密度 为验证方法准确性,进行样品加标回收实验,在1段婴幼儿配方乳粉和3段婴幼儿配方乳粉中添加不同浓度的混合标准溶液,加标水平为1、10、100 μg/kg,每个添加水平进行6次平行试验。

1.2.7 实际样品的测定 应用本文建立的方法对从市场购买的200份婴幼儿配方乳粉样品进行测定。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 材料本底的影响 实验发现塑料滴管、塑料离心管和有机滤膜都存在一定本底值,本底值的存在可能会出现假阳性结果,影响测定结果。用塑料滴管和塑料离心管做试剂空白,按1.2.2中的方法进行样品前处理,结果BPA为未检出,NP含量为10 μg/kg。实验中处理溶液上机前通常需要过有机滤膜,用清洗干燥的玻璃离心管做试剂空白,分别进行过有机滤膜膜试验和不过有机滤膜膜试验,BPA结果如图3所示,样品处理溶液经有机滤膜过滤后,BPA出峰保留时间处有响应,测定BPA含量为0.5 μg/kg,NP出峰保留时间处响应值明显增强,NP结果如图4所示,测定NP含量为35 μg/kg。样品处理复溶液不得过有机滤膜,采用高速离心的方法除去杂质。由以上实验表明,实验过程中不得使用塑料器皿和有机滤膜过滤复溶液,玻璃器皿使用前需要用乙腈清洗干净并烘干。

图3 BPA滤膜影响实验色谱图Fig.3 Chromatography of bisphenol A 注:a.不过膜；b.过滤膜;图4同。

图4 NP滤膜影响实验色谱图Fig.4 Chromatography of nonylphenol

2.1.2 流动相本底的影响 实验过程中发现流动相存在本底值BPA约为1 μg/kg,NP约为100 μg/kg。若不进行消除,在进行测定分析时,会直接影响目标物的定量,需要在进样过程中消除本底值,因此将本底与样品中目标物在色谱柱上进行分离,需要在流动相进入六通阀之前接上捕集柱,连上捕集柱后,目标物遵循先进先出原则,样品中目标物先进入色谱柱,流动相中目标物进入捕集柱,当达到流动相洗脱比例时,样品中目标物首先洗脱,然后流动相中本底目标物进入色谱柱分离。捕集柱连接方式见图2所示。

连接捕集柱和不接捕集柱时BPA分离色谱图如图5a和5b所示,NP分离色谱图如图6a和6b所示,图5b和图6b中当不连接捕集柱时BPA和NP分别只出一个峰,BPA色谱峰有明显干扰,定量结果偏高。图5a和6a中所示,当接捕集柱后BPA和NP色谱峰峰形对称,并且与捕集柱流出的色谱峰能达到基线分离。由于流动相中的BPA、NP会和样品中的目标物同时出峰,定量不准确,测定结果偏高,因此在进行BPA和NP分离时,需要按图2连接捕集柱,消除流动相中本底值的影响。

图5 BPA分离色谱图Fig.5 Separation chromatogram of BPA注:a. BEH C18色谱柱+连接捕集柱;b.BEH C18色谱柱; c. HSS T3 色谱柱+连接捕集柱;d. BEH C18 短色谱柱+连接捕集柱;图6同。

图6 NP分离色谱图Fig.6 Separation chromatogram of nonylphenol

2.1.3 提取溶剂的选择 婴幼儿配方乳粉中BPA和NP前处理分析常用的提取溶剂有乙腈、环己烷、乙酸乙酯、甲醇等。乙腈具有沉淀蛋白效果好,提取效率高,提取杂质少,操作简便等优点,因此采用乙腈作为提取溶剂。

2.1.4 提取方法的选择 加标回收率是实验室在分析检测过程中常用的一种质量控制方式,当加标回收率在一定范围时,表明该分析方法适用,反之则不适用。婴幼儿配方乳粉通过不同实验室用各自的实验方法对BPA和NP进行检测,以是否检出为依据确定样品为阴性还是阳性。实验中考察阴性样品和阳性样品加标回收率的影响,结果见图7所示,当加标量为10μg/kg时,阴性样品和阳性样品,在加水溶解提取和不加水溶解提取时,BPA、NP回收率差异不明显。

图7 不同提取方式对目标物回收率的影响Fig.7 Effect on recoveries of compounds with different extractive methods

用已知含量的质控样品进行实验也是分析过程中的一种质量控制方式,质控样品经过不同实验方法测定的含量偏差一般应小于15%。阳性样品是由不同实验室不同实验方法测定结果确定的。本文考察不同提取方式对阳性婴幼儿配方乳粉中BPA、NP提取效率的影响,分别研究乙腈直接提取和加水后用乙腈提取两种方式对阳性婴幼儿配方乳粉样品提取量的影响,结果见图8所示,阳性样品BPA和NP不加水提取分别为3.581和45.68 μg/kg,加水提取分别为12.051和273.20 μg/kg,加水分散溶解提取BPA和NP含量是不加水分散溶解提取的2～3倍。分析结果偏高可能有以下三方面原因:首先样品为干性样品,加水后能使样品充分溶解分散,乙腈与样品溶液能够充分接触并提取,提高提取效率;其次目标化合物极性比较大,水的极性和渗透性强于乙腈和甲醇等有机溶剂,加水后减弱了目标物与基质之间的相互作用,因此加水后样品的目标物更容易被溶剂提取,最后可能是因为样品中蛋白含量较高,乙腈具有沉淀蛋白的作用,当加入乙腈后,样品容易直接沉淀,目标物容易被沉淀包裹,影响提取效率。

图8 不同提取方式对阳性样品提取量的影响Fig.8 Effect on the extraction of positive samples with different extractive methods

由于加标时加入的目标物与样品接触较少,不加水分散溶解提取,也能容易直接被乙腈提取,导致两种提取方式回收率都符合方法学要求。两种提取方式回收率均正常,但通过对阳性样品两种提取方式的考察表明,婴幼儿配方乳粉直接用乙腈提取时,提取效率较低,所以实验选择加水溶解分散后再用乙腈提取的方式。

2.1.5 加水量的优化 实验中选择先加水溶解分散再用乙腈提取的前处理方式,因此本文考察加水量为0.5、1、1.5、2、5 mL时,对阳性样品检测结果的影响。研究发现:当加水量0.5 mL时,样品不能完全溶解,测定结果偏低;当加水量1 mL时样品能溶解,但随着加水量的增加,检测结果变化很小。加水量大于1 mL时,沉淀效果变差,并且在氮吹时由于提取溶液中水含量变高,实验过程耗时延长。因此综合考虑实验选择加水量为1 mL。

2.2 液相色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的优化 色谱柱直接影响目标化合物的分离效果,选择合适的色谱柱才能够使定性定量结果准确可靠。BPA、NP属于极性化合物,适合在反相色谱柱上保留分析,因此试验比较HSS T3色谱柱(2.1×100 mm,1.8 μm)、BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,1.8 μm)、BEH C18短色谱柱(2.1×75 mm,1.8 μm)三种反相色谱柱并且连接捕集柱时对BPA分离效果分别见图5c,5a,5d,NP在三种反相色谱柱上的分离效果分别见图6c,6a,6d所示。结果表明在BEH C18短色谱柱上BPA不能完全达到基线分离,NP完全分离不开。BPA和NP在BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和HSS T3色谱柱上有保留,但BPA在HSS T3色谱柱上保留较强,样品中和流动相捕集的BPA分离不如BEH C18色谱柱好,婴幼儿配方乳粉基质复杂,在实际测定时样品中BPA在HSS T3色谱柱上容易与流动相捕集的BPA不能实现完全基线分离,干扰测定,导致分析结果有偏差;目标物在BEH C18色谱柱上完全能够达到基线分离,并且无干扰,所以采用BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)用于后续实验。

2.2.2 流动相条件的优化 流动相组成能够影响目标化合物的分离和离子化效率,分别试验了甲醇-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L乙酸铵、甲醇-0.1%氨水三种流动相在BEH C18色谱柱上对目标化合物分离情况和对目标物离子化效率的影响。结果表明,当流动相为0.1%甲酸和10 mmol/L乙酸铵时,目标化合物色谱峰有分叉,当流动相使用0.1%氨水时,目标化合物色谱峰峰形好。当流动相中加入甲酸或乙酸铵时,抑制了BPA和NP的离子化效率,峰面积响应降低。当流动相为甲醇-0.1%氨水时,峰面积响应提高,分析可能是因为流动相中能够提供OH-会消耗H+,促进目标化合物电离,提高目标化合物的离子化效率。因此选择甲醇-0.1%氨水为流动相进一步实验。

2.3 质谱条件的优化

液相色谱串联质谱分析检测中常用的电离源有两种ESI电离源和APCI电离源,根据化合物的结构可以看出BPA和NP都属于极性化合物,APCI电离源的优势在于检测非极性化合物,ESI电离源的优势在于检测极性化合物,因此试验中选择ESI电喷雾电离的分析方式。

BPA和NP分子结构中含有酚羟基,容易在化合物电离时失去氢,从而形成[M-H]-的准分子离子峰,所以在四级杆质谱分析检测中选择离子源电离模式时,负离子模式应该优先考虑。将100 ng/mL的BPA和NP混合标准溶液直接注入质谱仪,在ESI-模式下进行母离子扫描,确定目标化合物的准分子离子峰丰度最大条件,得到BPA和NP母离子分别为m/z 226.9和219.2;调节最优的质谱参数,对目标化合物进行子离子扫描,然后优化碰撞电压等质谱参数,选择其中无干扰且丰度较高的两对子离子,将离子丰度相对高的子离子226.9>212.2和219.2>133.0分别作为BPA和NP的定量离子,将离子丰度相对较低的子离子226.9>133.0和219.2>147.0分别作为BPA和NP的辅助定性离子。

根据化合物分子结构结合质谱碎片信息,推测可能的裂解机理分析,NP的裂解机理可能是母离子m/z 219.2分别断裂失去两段直链烷基C5H12和C6H14得到m/z 147.0和133.0的子离子。BPA裂解机理可能是由母离子m/z 226.9的[M-H]-断裂失去CH3得到的子离子为m/z 212.2,断裂失去C6H6O得到的子离子为m/z 133.0。

2.4 方法的线性范围和检出限

BPA和NP线性范围,回归方程和线性相关系数见表3所示。以信号与噪音比值S/N≥3作为检出限(LOD),结果为0.1 μg/kg。

表3 化合物线性范围,回归方程和线性相关系数Table 3 Linear range,regression equation and linear correlation coefficient of compounds

2.5 方法的回收率和精密度

按上述试验条件进行处理和测定,结果见表4,BPA、NP的平均加标回收率在89.5%～102.8%之间,其相对标准偏差为 1.3%～4.8%,由此可见,本方法精密度良好,满足实验需求。

表4 添加回收率与精密度(n=6)Table 4 Recovery and RSD for the determination of compounds(n=6)

2.6 实际样品的测定

其中有23份样品检出BPA,含量为0.1～30.0 μg/kg,有180份样品检出NP,含量为1.1～105 μg/kg。测定结果显示NP广泛存在于婴幼儿配方乳粉中。

3 结论

利用UPLC-MS/MS法结合在线捕集技术建立检测婴幼儿配方食品中BPA和NP的方法。该方法通过比较加水与不加水两种不同提取方式对提取效率的影响,优化实验前处理过程,优化色谱、质谱条件,确定选择样品加1 mL水溶解乙腈提取的前处理方式,样品溶液冷冻除去杂质,浓缩上机,结合流动相在线捕集消除本底技术,以甲醇-0.1%氨水溶液为流动相,BPA、NP在BEH C18色谱柱上进行分离,研究了BPA和NP的质谱裂解机理,采用同位素内标法进行定量分析。

本方法线性范围宽,检出限低,提取效率高,灵敏度高,定性、定量准确,适用于婴幼儿配方乳粉中BPA和NP的定性确证与定量检测,填补了国内UPLC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中BPA和NP标准方法的空白。可以为婴幼儿配方乳粉中的BPA、NP的测定提供科学依据,为产品质量控制、风险评估或监管提供有力技术支撑。