金枪鱼红肉酶解液对小鼠抗疲劳和调节肠道菌群效果的研究

李淑凡,李 鑫,韩姣姣,芦晨阳,*,周 君,李 晔,苏秀榕,*,陈义方,王求娟

(1.宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211; 2.浙江省象山县公安司法鉴定中心DNA实验室,浙江宁波 315700; 3.宁波今日食品有限公司,浙江宁波 315000)

金枪鱼(Thunnusthynnus)属于脊索动物门,硬骨鱼纲,鲈形目,鲭科[1]。金枪鱼需要不停的游动来呼吸氧气,因此其对运动性疲劳具有较强耐受能力,含有丰富的抗疲劳活性物质。金枪鱼红肉腥味大、口感差,虽然具有丰富的蛋白质、氨基酸、多不饱和脂肪酸和矿物质元素,但是一般被作为加工副产物丢弃。

疲劳是机体复杂的生理生化过程,也是现代社会一种常见的亚健康状态。机体长期处于疲劳状态,会对健康产生不良影响。一些抗疲劳物质可以起到延缓疲劳产生和加速疲劳消除的作用,包括多肽、多糖、苷类、萜类和黄酮类化合物等[2-4]。来源于金枪鱼红肉的多肽,是否具有抗疲劳作用,目前尚未有系统研究。

近年来,肠道菌群逐渐成为功效因子研究领域热点,引起人们广泛关注。有研究表明,肠道菌群与抗疲劳能力具有相关性,中长跑运动员肠道菌群结构与普通人差异显著[5];而益生菌及其发酵产物的补充可以有效增强机体抗疲劳能力[6]。因此,也同时研究了金枪鱼红肉酶解液对肠道菌群的影响。

本实验以金枪鱼红肉为研究对象,利用酶解法制备红肉酶解液并进行多肽组成和丰度的测定,随后考察酶解液对小鼠抗疲劳和抗氧化的效果,并探究其对小鼠肠道菌群的调节作用。通过上述研究,初步明确金枪鱼红肉酶解液对小鼠的抗疲劳效果,及其对肠道菌群调节的益生元效应[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金枪鱼红肉 宁波今日食品有限公司;胰蛋白酶和碱性蛋白酶 美国Sigma公司;ICR雄性小鼠和雌性小鼠各12只 浙江省实验动物中心(SCXK Zhejiang 2014-0001 No. 1605200003);小鼠饲料 宁波大学实验动物中心;肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸和丙二醛(MDA)检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;TIANamp Stool DNA Kit粪便基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司。

S2-A81型不锈钢小型搅拌机 中国九阳股份有限公司;真空冷冻干燥机 美国LABCONCO公司;5418R型离心机 德国Eppendorf公司;5800型MALDI-TOF/TOF系统 美国AB SCIEX公司;YLS-4C型转棒式疲劳仪 淮北正华生物仪器设备公司;NanoDrop 2000C 美国Thermo Fisher公司;高通量测序仪 美国Illumina公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金枪鱼红肉酶解 利用绞肉机将金枪鱼红肉绞成鱼泥,随后按照固液比1∶9稀释金枪鱼鱼泥,加入3%的蛋白酶混合物(胰蛋白酶∶碱性蛋白酶=1∶2),在56 ℃下加热搅拌4 h完成酶解。沸水浴10 min将酶失活,12000 r/min高速离心后取上清,置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24 h,备用。

1.2.2 酶解液多肽鉴定 将适量冻干产物重新溶解于60 μL甲醇水混合物(甲醇∶水=50∶50),加入终浓度为0.2%的甲酸和2 mmol/L的乙酸钠,制成样品溶液。将0.5 mL样品置于MALDI板上,与2.5 mmol/L二羟苯甲酸溶液等量混合,待板上样品于真空中干燥均匀结晶之后,利用一级质谱确定多肽分子量,利用二级质谱确定多肽氨基酸组成,获得的数据利用MASCOT软件与数据库进行比对分析,确定可能的多肽结构。

1.2.3 动物饲养 24只8周龄ICR小鼠经过2周的适应,分成两组(对照组和实验组),每组12只,雌雄各半。实验组小鼠每天定时灌胃1次酶解液(300 mg·kg-1·d-1)[8],对照组灌胃等量生理盐水。灌胃实验开始时进行小鼠粪便收集和小鼠初始体重测定(0周),随后每周末称量体重1次,持续8周;4周末和8周末分别收集小鼠粪便,所有粪便均置于-80 ℃备用。实验过程中,小鼠自由摄食和饮水,控制室温23～25 ℃,湿度50%～70%,明暗交替条件12 h/12 h。

1.2.4 体重增加量 小鼠体重增加量按照如下公式测定:

体重增加量=最终体重(8周)-初始体重(0周)。

1.2.5 转棒能力测试 8周后,将小鼠置于转速15 r/min的转棒上训练爬行,每批30 min,训练4 d。第5日,将转速增加到40 r/min,记录每只小鼠的跌落时间,即为疲劳耐受时间[9]。

1.2.6 血清和肝脏中生化指标的测定 实验结束之后,将小鼠麻醉眼球取血,4 ℃ 3000 r/min离心15 min取血清,置于-80 ℃备用;随后将小鼠脱颈处死,取肝脏并去除表面血污,称重记录并计算肝脏系数,随后置于-80 ℃备用。其中肝脏系数按照如下公式测定肝脏系数=肝脏总质量(mg)÷体重(g)。参照试剂盒中的说明,分别对肝脏和血清中的CK、LDH、GSH-Px、SOD、LD和MDA进行测定。

1.2.6 粪便总DNA提取和肠道菌群16S rRNA测序分析 利用试剂盒提取粪便总DNA,并利用NanoDrop2000C对其质量进行检测[10]。利用引物319F和806R对肠道菌群16S rRNA的V3和V4区进行扩增:预变性98 ℃ 30 s,35个循环,每个循环包括:变性98 ℃ 10 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,最后延伸10 min[11]。琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况,合格的PCR产物送杭州联川生物科技有限公司进行测序。

将有效序列中相似度超过97%的序列聚簇成同一个操作分类单元(OTUs)并进行注释[12-13]。利用Mothur和R软件包进行α和β多样性分析[14]。利用冗余分析(RDA)筛选关键OTUs[15]。

1.3 数据处理

所有数据均以平均值±标准偏差(means±SD)形式表示。当数据满足正态分布时,利用SPSS软件中的ANOVA和Tukey’s post-hoc进行分析;当数据不满足正态分布时,利用MATLAB R2012a中的Mann-Whitney进行分析。当P<0.05时,即认为存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 金枪鱼红肉酶解液中多肽组成和丰度

在质核比0～2000范围内,酶解液中一共检测到403个峰,相对强度最高的10个多肽累计相对强度为17.03%(表1),前三位分别是多肽KEFT(赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸),EEASA(谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丙氨酸)和RYDD(精氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),相对强度分别为4.24%、3.93%和3.43%。动物实验和临床研究证明,精氨酸(R)和亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)三种支链氨基酸具有抗疲劳效果[16-17]。金枪鱼红肉酶解液高丰度多肽多含有一个或多个抗疲劳氨基酸,推测其具有抗疲劳效果。

2.2 小鼠疲劳指标的比较

2.2.1 疲劳相关的生理指标 在8周里,酶解液减缓了小鼠的体重增加(图1A),降低了最终体重增量,雌雄小鼠间不存在显著性差异(图1B)。抗疲劳能力与机体肝脏功能之间存在较为密切的联系[18],本研究对肝脏系数进行了定量分析。结果发现,酶解液增加了小鼠的肝脏系数(图1C)。转棒实验表明,酶解液将雄性和雌性小鼠的转棒时间分别延长了72.8%和70.8%(图1D),说明金枪鱼酶解液显著提升了小鼠抗疲劳能力。

图1 疲劳相关的生理指标Fig.1 Physiological indexes related to fatigue.注:**表示差异极显著,P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。图2、图3同。

2.2.2 疲劳相关的生化指标 肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和乳酸(LD)含量是常见的用于衡量疲劳状态的关键性指标,疲劳状态与肌酸激酶活力和乳酸含量呈正相关,与乳酸脱氢酶活力呈负相关[19]。本研究中,酶解液降低了血清中肌酸激酶活性和乳酸含量,增加了乳酸脱氢酶活性,雌雄小鼠变化规律一致(图2A～C)。一般认为,提高体内抗氧化酶的活性,清除超氧阴离子自由基,可以达到抗疲劳的效果。本研究中,酶解液增加了血清和肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,降低了丙二醛浓度(图2D～F)。

图2 疲劳相关的生化指标Fig.2 Biochemical indexes related to fatigue

2.3 小鼠肠道菌群物种丰度和多样性分析

Observed species指数和Chao1指数用来表征肠道菌群物种丰富度,Shannon指数用来评估肠道菌群物种多样性。结果发现,酶解液降低小鼠肠道菌群的丰富度(图3A、B),极显著降低8周雌性小鼠菌群的多样性(P<0.01)，而对雄性小鼠菌群多样性没有影响(图3C)。以上分析表明,酶解液对肠道菌群的丰富度和多样性均具有影响,且对多样性的影响具有性别差异。肥胖会导致肠道菌群丰富度和多样性的降低[20],但是同为慢性代谢综合症的2型糖尿病和D-半乳糖诱导的脑衰老则会导致肠道菌群丰富度和多样性的增加[21-22]。因此,简单地通过菌群丰富度和多样性参数的变化,不足以评估酶解液的益生元效果。

图3 小鼠肠道菌群物种丰富度和多样性Fig.3 Bacterial richness and diversity of gut microbiota in mice

2.4 小鼠肠道菌群结构分析

为了进一步明确酶解液对小鼠肠道菌群的影响,我们对肠道菌群结构进行了加权主坐标分析(Weighted Unifrac Principal Co-ordinates Analysis)。雌雄小鼠的肠道菌群结构存在差异,雌性小鼠组全部位于PCoA1轴的上方,而雄性小鼠组全部位于PCoA1轴的下方,这种肠道菌群结构的性别差异在之前的文献中多有报道[23-24]。在0周时,实验组和对照组小鼠的菌群结构没有差别,而随着灌胃时间的延长(4周和8周),菌群结构逐渐产生差异(图4)。

图4 小鼠肠道菌群的加权主坐标分析结果Fig.4 The results of weighted unifrac principal co-ordinates analysis

2.5 小鼠肠道菌群分类结构变化

2.5.1 门水平相对丰度 小鼠肠道菌群中拟杆菌门和厚壁菌门是相对丰度最高的两个菌门(图5A)。酶解液使雄性小鼠拟杆菌门的相对丰度从66.5%±5.0%降低到55.4%±4.8%(P<0.05),厚壁菌门的相对丰度从29.9%±4.6%升高到33.7%±4.6%;而使雌性小鼠的拟杆菌门从42.9%±5.0%增加到61.9%±4.4%,厚壁菌门从53.5%±4.9%降低到33.9%±4.6%,说明这两个主要菌门的丰度变化存在性别差异。

2.5.2 纲水平相对丰度 纲水平结果表明,拟杆菌纲(Bacteroidia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和梭菌纲(Clostridia)是小鼠肠道菌群中的主要菌纲(图5B),其中拟杆菌纲属于拟杆菌门,芽孢杆菌纲和梭菌纲属于厚壁菌门。在雄性处理组中,拟杆菌纲和芽孢杆菌纲相对丰度均降低,而梭菌纲丰度升高;在雌性处理组中,拟杆菌纲丰度先降低再升高,芽孢杆菌纲丰度升高而梭菌纲丰度降低。

图5 小鼠肠道菌群在门水平和纲水平的相对丰度Fig.5 Relative abundance of gut microbiota in the phylum and class levels

本研究中门水平和纲水平的菌群变化规律较为复杂,难以得到一致性的规律,

这可能是由于门水平和纲水平的分类层级较高,在相同的门或者纲下面包含不同的目、科、属和种的微生物,这些微生物在功能和特性上存在较大的差异,对酶解液响应也各不相同。

2.6 小鼠肠道菌群中功能操作分类单元(OTUs)分析和鉴定

在雄性小鼠的17个关键性OTUs中(图6A),丰度上升的OTUs有6个,属于乳酸菌属和未分类的梭菌目等;丰度下降11个,

图6 雄性(A)和雌性(B)小鼠中的关键OTUsFig.6 Key OTUs responding to hydrolysate of tuna dark meat treatment in male(A)and female mice(B)注:OTUs按照进化树排列,利用颜色表征OTUs丰度,处理之后丰度增加的 OTUs用下划线标注,OTUs对应的分类信息(门和属)标注在右侧。

属于未分类的梭菌目等。研究表明,乳酸菌及其发酵产物可以增加小鼠耐力,对慢性疲劳综合症的缓解具有效果[25-26];梭菌XlVa簇是一种短链脂肪酸产生菌,具有提高肠道挥发性脂肪酸含量和抗氧化的能力[27]。这两个属丰度的增加,可以促进小鼠耐力和抗氧化能力的提高。此外,同属于未分类的梭菌目的两个OTUs具有相反的变化趋势,推测是不同种水平的变化差异导致属水平变化趋势的不一致[28]。

在雌性小鼠的58个关键OTUs中(图6B),丰度上升和下降的OTUs 分别有34个和24个。本研究共鉴定到9个关键OTUs属于乳杆菌属,其中7个的丰度上调。乳杆菌属是耐力运动的运动员肠道中的优势菌群,其发酵产物具有抗运动疲劳作用[29-30]。瘤胃球菌属也属于短链脂肪酸产生菌,其有助于肠道稳态的维持[31],本研究中有3个关键OTUs属于瘤胃球菌属,其中一个丰度增加,另两个丰度下降。此外,有16个属于未分类的卟啉单胞菌属的OTUs丰度上升。卟啉单胞菌属已被证明与口腔炎症有关[32],酶解液为何会促进其在雌性小鼠肠道菌群中大幅增加,仍需进一步研究。

雌雄小鼠关键OTUs相似度极低,仅有3个共有OTUs,其中2个变化趋势一致。这说明酶解液对肠道菌群的调节具有性别差异。但是,这个差异性的菌群调节是否是抗疲劳效果差异的原因之一,仍需要进一步的研究。

3 结论

本研究鉴定了金枪鱼红肉酶解液中的多肽组成及其丰度,并考察了其在小鼠中的抗疲劳、抗氧化效果;同时从肠道菌群角度,研究了酶解液对肠道菌群的调节作用。结果表明,金枪鱼酶解液中的优势多肽多含有支链氨基酸和精氨酸等与抗疲劳效果有关的氨基酸;酶解液增加了小鼠的抗疲劳和抗氧化能力,增加了血清和肝脏中乳酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活力,降低了肌酸激酶活力、乳酸和丙二醛含量。

酶解液对肠道菌群的调节具有性别差异:雄性小鼠菌群物种丰富度降低,多样性保持不变,而雌性小鼠菌群物种丰富度和多样性均降低;雄性小鼠拟杆菌门相对丰度降低而厚壁菌门相对丰度升高,而雌性小鼠这两个门的变化趋势正好相反;雄性小鼠和雌性小鼠中分别鉴定得到17个和58个关键性OTUs,相同的关键性OTUs仅为3个,其中2个OTUs变化趋势一致。

综上所述,金枪鱼红肉酶解液因含有丰富的精氨酸和与抗疲劳相关的支链氨基酸,对小鼠具有抗疲劳、抗氧化的效果,对肠道菌群也具有一定的调节作用,这种调节存在性别差异性。