西藏昌都市藏族育龄妇女MTHFR和MTRR与不良妊娠结局关系的研究*

杨晓黎，郑晓华，高玉兰，彭佳琼，四郎拥宗，刘欣雨

(1.西藏自治区昌都市人民医院 854000；2.重庆三峡中心医院 404100；3.解放军第三二四医院，重庆 400000)

叶酸也叫维生素B9，可参与人体内多种能量代谢的过程，对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成均起到重要作用[1]。在胚胎形成和胎儿发育的过程中，人体对叶酸的需求会急速增加。为孕前及孕早期女性补充小剂量的叶酸可有效防止胎儿神经管缺陷的发生[2]。为了加强出生缺陷干预方面的工作，降低胎儿神经管缺陷的发生率，近年来国家人口和计划生育委员会及财政部共同实施了为孕产妇免费发放叶酸的工作[3]，我国多个省份也将“增补叶酸”列为其“妇幼重大公共卫生服务项目”，并每年进行相关指标的绩效考核。临床实践证实，围生期女性增补叶酸的规范性与其是否接受有效的健康教育有密切的关系。

我国原卫生部也于2009年6月启动了“增补叶酸预防神经管缺陷”重大公共卫生项目，向农村及城镇妇女免费发放叶酸，目前已取得了显著成效。但由于我国幅员辽阔，不同地区的生活习惯、饮食习惯乃至饮用水都有明显差异，因此我国围生期妇女每日补充多少剂量的叶酸才能实现所需水平，目前尚无统一定论，不同研究和不同地区的情况都不一致，需要多中心、大样本量的研究数据统计。本研究的目的在于分析西藏自治区昌都市藏族妇女亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点、MTHFR基因A1298C位点、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因A66G位点多态性在正常人群和有不良妊娠结局史人群的分布情况，以探讨叶酸代谢基因与不良妊娠结局的关系，为该地域的人群预防出生缺陷制订具有针对性的干预措施并提供有效的科学依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取西藏自治区昌都市人民医院的718例建卡及做孕期保健的藏族女性为研究对象，平均年龄28.3岁。在探究叶酸基因多态性与不良妊娠结局的关系中，以427例无不良妊娠结局史的妇女为对照组，以291例具有不良妊娠结局史如自然流产、早产、子痫前期、死胎死产、先兆流产、胎儿畸形、妊娠高血压的妇女为病例组进行分组研究。所有受检者均在签署知情同意书后，通过提取口腔黏膜细胞中的DNA进行基因检测，评估其叶酸利用能力。

1.2方法

1.2.1标本DNA采集 由经过专业培训的人员进行标本采集工作。使用专用的口腔黏膜上皮细胞采集器进行操作，提取受检者的口腔黏膜上皮细胞，具体方法为：在口腔内一侧上下刮拭40次以上，力量以略微鼓起为宜，然后利用柱式抽提试剂盒抽提标本的DNA。

1.2.2基因检测 MTHFR基因C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的SNP分型采用Taqman-MGB技术测定，相关仪器、试剂均使用美国Applied Biosystems(AB)公司产品。

1.2.3荧光定量PCR检测 对3个位点同时进行荧光定量PCR反应，反应所用探针信息见表1。每个反应体系的总体积为10.0 μL，包含浓度为20 ng/μL的DNA模板1.0 μL，2×Taqman Universal Master Mix 5.0 μL，20×Taqman-MGB探针0.5 μL，去离子水3.5 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，20个循环扩增，再进行30个循环的扩增(80 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s)。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样品的基因分型结果。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0 软件进行数据分析，计数资料以频数或百分率表示，比较采用χ2检验；采用HaploView4.2软件进行Hardy-Weinberg平衡及连锁不平衡水平(LD)分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Hardy-Weinberg平衡检验 本研究Hardy-Weinberg平衡校验目的是验证标本的可靠性。结果表明，收集到的西藏自治区昌都市藏族人群的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分布情况符合遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体，标本具有区域代表性。

2.2基因型频率分析 本研究对427例病例组和291例对照组进行基因型频率分析，结果显示两组MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3等位基因分布情况 对427例病例组和291例对照组进行等位基因频率分析，结果显示两组MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 Taqman-MGB探针所在位置

表2 两组MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点基因型频率比较[n(%)]

表3 两组MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点等位基因频率比较[n(%)]

2.4MTHFR基因两位点单倍型分析及连锁情况 西藏自治区昌都市藏族育龄妇女MTHFR基因C677T和A1298C两位点的组合情况有6种可能。单倍型分析表明，存在3种组合：CA占74.8%，TC占21.3%，TA占3.9%。MTHFR基因C677T和A1298C两位点存在较高程度的连锁不平衡现象(D′=1.0，r2=0.803)，见表4。

2.5基因多态性与不良妊娠结局的关系 将291例病例组中不良妊娠结局细分为自然流产、早产、子痫前期、死胎死产、先兆流产、胎儿畸形和妊娠高血压与对照组进行分析，发现早产患者MTHFR C677T基因多态性的分布与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=12.89,P<0.05)，见表5，其等位基因的分布与对照组比较，差异有统计学意义(χ2=10.67,P<0.05)，见表6。

表4 MTHFR基因C677T和A1298C位点连锁型分布[n(%)]

表5 两组MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多态性位点分布比较[n(%)]

a：P<0.05，与对照组比较

表6 两组MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多态性位点等位基因分布比较[n(%)]

续表6 两组MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多态性位点等位基因分布比较[n(%)]

a：P<0.05，与对照组比较

2.6MTHFR基因型与早产的Logistic分析 通过单因素分析发现早产与MTHFR C677T基因型具有相关性(χ2=12.89,P<0.05)。以MTHFR C677T基因型为自变量(CC型=1，CT型=2，TT型=3)，早产为因变量作Logistic回归分析，结果显示CT型OR=1.83，95%CI为0.80～4.19(P=0.153)；TT型OR=5.73，95%CI为2.05～16.00(P=0.001)。

3 讨论

叶酸是人体所需的重要营养素，属于B族维生素。叶酸在体内被还原成具有生理活性的5-甲基四氢叶酸(活性叶酸)，作为一碳单位的供体，主要参与DNA氧化损伤修复、细胞增殖及组织生长过程[4-5]。在叶酸代谢通路中，有多种酶共同参与了叶酸的转运和代谢，其中MTHFR、MTRR为叶酸代谢的关键酶，MTHFR和MTRR基因在自然人群中存在单核苷酸多态性(SNP)，其突变可引起酶活性的改变[6]，并造成叶酸代谢的异常，使得活性叶酸水平降低[7]及同型半胱氨酸(Hcy)水平升高[8-9]。

据报道，MTHFR和MTRR基因突变与多种出生缺陷相关。早有研究证实母亲MTHFR 677C>T和MTRR 66A>G位点多态性是子代发生神经管畸形的危险因素[10-11]。LI等[12]通过Meta分析，指出MTHFR 677C>T多态性是先天性心脏病发生的危险因素。WU等[13]Meta分析结果表明，亚洲妇女携带MTHFR基因677T位点等位基因增加唐氏综合征患病风险(OR=1.75，95%CI：1.084～2.824，P=0.022)。MTHFR基因C677T位点多与人体内叶酸缺乏及其各种症状直接相关，而MTHFR A1298C和MTRR基因A66G位点更偏向于通过影响血浆Hcy水平而间接影响人体代谢。本研究在进行相关分析的时候也支持了这一点，即在西藏昌都市育龄妇女的叶酸代谢基因多态性与不良妊娠结局分析中，两组MTHFR C677T基因多态性比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明西藏昌都市育龄妇女的叶酸代谢基因多态性与总不良妊娠结局无相关性。值得注意的是，将不良妊娠结局的因素进行具体划分，发现病例组早产妇女MTHFR C677T基因多态性与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这与已有的研究报道不同，推测这与本研究样本量较小有关。另外，为了进一步揭示该地区人群中MTHFR基因C677T位点与早产发生之间的联系，从而进行了Logistic分析，发现TT型OR=5.73，95%CI为2.05～16.00(P<0.05)，表明西藏昌都市育龄妇女的C677T TT型是导致早产发生的风险因素，其发生早产的风险是野生型的5.73倍，提示在今后的临床诊疗中，应关注叶酸基因的缺陷情况，并提供相关的叶酸补服建议。

此外，值得注意的是，西藏地处“世界屋脊”青藏高原，其独特的地理位置造就了当地长期困难的交通和相对与世隔绝的生活习惯。在一项较小样本量的研究中就曾指出，西藏藏族女性C677T位点TT基因型频率显著低于汉族女性[14]。因此，推测叶酸基因多态性分布可能呈现与全国其他民族不同的个性化趋势。本研究通过分析发现西藏昌都市藏族妇女的MTHFR基因C677T位点TT基因型频率为6.32%，低于文献报道中的思南苗族[15](12.9%)、延边朝鲜族[16](18.8%)、银川回族[17](16.5%)、新疆维吾尔族[18](10.9%)、张家界土家族[19](14.6%)，高于南宁壮族[20](5.1%)、乌苏哈萨克族[21](5.0%)，总体上呈现MTHFR基因A1298C位点上的C等位基因频率从北到南整体逐渐升高的趋势。根据以上数据对比可以看出，不同民族MTHFR、MTRR的基因多态性分布有所不同，其分布具有民族特异性。

本文通过开展对西藏昌都市藏族妇女MTHFR和MTRR基因多态性与不良妊娠结局关系研究，可了解西藏昌都市藏族妇女个性化的基因分布特点，揭示了不良妊娠结局与叶酸代谢基因的关系，可指导医务工作者采取个性化的围产干预措施，减少出生缺陷的发生。但本研究同时存在不足，如样本量较小，关于叶酸基因多态性与不良妊娠结局之间的机制也待进一步探索。