荧光定量PCR法与直接涂片抗酸染色法检测结核杆菌结果对比

季雪兰

宿迁市钟吾医院，江苏 宿迁 223800

肺结核是一种临床常见病，近年来，由于空气污染、吸毒、HIV感染等因素的影响，人体免疫功能明显降低，肺结核的发病率显著增高，肺结核已成为目前严重危害我国人类身体健康的重大疾病[1]。目前，临床诊断肺结核的方法有实验室诊断、X线诊断以及临床症状等，直接涂片抗酸染色是临床常用的实验室诊断方法，灵敏度以及特异性相对较低，牛群[2]等学者认为，荧光定量PCR法在结核杆菌诊断中准确性相对高于直接涂片抗酸染色检测，临床应用价值较高。鉴于此，本文为进一步研究荧光定量PCR与直接涂片抗酸染色在肺结核患者痰标本诊断中的应用价值，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2017年4月-2018年12月为研究时间，医院伦理委员会已批准本次研究，研究对象是本院检验科收集的150例疑似肺结核患者痰标本。64例女性、86例男性；年龄22-78岁，年龄（50.62±5.49）岁；病程在2-18周，病程均值（10.26±1.14）周；体重45-92kg，体重均值（68.52±5.46）kg。乙组（75例）。排除研究前4周进行抗结核治疗者；处于哺乳、妊娠期女性；免疫系统疾病。

1.2 方法 仪器、试剂：PCR荧光定量分析仪（型号：ABI StepOne；生产企业：上海实维实验器材技术有限公司），试剂由艾康生物科技（杭州）有限公司提供。抗酸染液：珠海贝索生物技术有限公司提供。

检测方法：严格遵守《全国临床检验操作规程》及产品操作说明书（1）荧光定量PCR：a：在待测痰液中加入4倍体积的4%NAOH,混匀，室温下放置30分钟至1小时使其充分液化。b；取液化后的标本0.5mL于1.5mL的离心管中加入4%NAOH后放置10分钟，速率为13000r/min，离心10min。C：去上清，沉淀中加入1mL灭菌生理盐水，振荡并摇晃均匀。速率为13000r/min，离心10min。再重复洗涤一次。d：去上清，沉淀中加入核酸提取液50ul，摇晃均匀，在100℃的温度下恒温处理10min，然后12000r/min，离心10min，弃上清置于备用。e：取阴阳对照各20ul，分别加入取2uL核酸提取液，混匀后在100℃的温度下恒温处理10min，然后12000r/min，离心10min，弃上清置于备用。f：试剂配制。g：加样。h：PCR扩增及荧光检测。结果解释：检测样本CT值无数据时，报告为阴性，检测样本CT≤38.0者为阳性，检测样本CT＞38.0为实验灰区（2）抗酸染色：挑取痰标本中干酪样、脓样、或可疑部分0.05mL，与玻片上均匀涂抹成10mm＊20mm的卵圆形痰膜，自然干燥，紫外灯下照射1小时灭菌，加热固定，然后进行抗酸染色，染色完成后置于显微镜下观察：观察300个视野未发现抗酸杆菌报告阴性，发现1-2条及以上报告为阳性。

1.3 观察指标 对比两种检测方法抗酸杆菌阳性检出率。

1.4 统计学方法 数据处理选择SPSS26.0软件，t检验计量资料，以（Mean±SD）形式表述，χ2检验计数资料，以[n/（%）]表述，P＜0.05，即为存在统计学差异。

2 结果

2.1 对比两种检测方法结核杆菌阳性检出率 荧光定量PCR结核杆菌阳性检出率（90.00）明显高于直接涂片抗酸染色结核杆菌阳性检出率（74.67%），P＜0.05（差异均具有统计学意义），见表1。

表1 对比两种检测方法抗酸杆菌阳性检出率[n/（%）]

2.2 对比两种检测方法结核杆菌特异性及敏感性 荧光定量PCR检查特异性（86.67%）、敏感性（97.78%）均明显高于抗酸染色特异性（60.53%）、敏感性（89.29%），P＜0.05（差异均具有统计学意义），见表2、表3。

表2 荧光定量PCR检查结果

表3 直接涂片抗酸染色检查结果

3 讨论

结核病的诊断一直以来均依赖于直接涂片抗酸染色检查，但直接涂片抗酸染色检查的阳性检出率普遍较低，且容易受到标本、试剂、人为等因素影响，在结核病诊断中具有一定的局限性[3]。荧光定量PCR主要检测“TB-DNA”，充分利用了PCR（聚合酶链反应）特异性、敏感性高等特点将DNA以及PCR探针杂交技术集为一体，可以直接探测PCR过程中的荧光变化情况，以DNA模板获取准确的定量结果，弥补了抗酸染色检查的不足，极大的提高了结核杆菌阳性检出率，具有可定量、灵敏度高、特异性高、操作简单、污染少、可定量等优点。荧光定量PCR法CT值与DNA量对数呈线性关系，如果信号增强至荧光阈值，则CT值会被记录下来，根据CT值可以将样本中的TB-DNA含量计算出，起始拷贝数量越多，CT值越小。王霖[4]等研究结果与本研究结果接近，提示荧光定量PCR检查法在结核病诊断中应用价值较高。

综上所述：结核病患者采纳荧光定量PCR检测，可显著提高结核杆菌阳性检出率，为患者早期接受针对性治疗提供科学的参考依据，临床价值较高，值得将该检测方法进一步推广。