Klotho蛋白对缺血再灌注急性肾损伤中Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白表达的影响

董丽娜，赵晔，于磊，刘国平，刘艾芹

急性肾损伤(AKI)是临床常见的一种综合征，主要表现为急性肾功能减退，其病情凶险、发病率及预后差，可进展为慢性肾脏病[1-2]。目前对AKI尚无完全有效的治疗方法，因此早期诊断并采取有效治疗措施对改善患者预后有着重要意义[3]。AKI的病理及生理变化非常复杂，其分子机制目前尚未完全清楚，积极探索AKI的分子作用机制利于发现新的治疗方式[4]。缺血再灌注是AKI 最常见的病因，本研究通过小鼠缺血再灌注造模AKI，可有效探讨其分子作用机制。Klotho 是一种抗衰老基因，可作为反映早期肾损伤标志物，并可成为早期诊断 AKI 的依据，成为其治疗靶点[5]。本研究通过缺血再灌注急性肾损伤小鼠给予Klotho蛋白干预，分析其对Bax、Bcl-2、p62以及LC3蛋白表达的影响，以期为AKI的治疗提供新的思路，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：雄性健康小鼠60只，8周龄，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心，饲养于清洁级实验室中。(2)试剂：兔抗小鼠 p62抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体及LC3抗体均购自上海研谨生物科技有限公司；Western-blot及凝胶电泳试剂均购自南京凯基生物有限公司；重组可溶性 Klotho蛋白购自美国R&D公司。(3)仪器设备：切片机(OPJ-1B型，天津天利航空机电有限公司生产)、离心机(TG16型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司生产)、恒温箱(SHHW21.420型，北京永光明仪器有限公司生产)、显微镜(Olympus IX71型，日本OLYMPUS生产)、全自动生化分析仪(AU5800型,日本OLYMPUS生产)、电泳仪(Bio-RaD型，美国Bio-Rad公司生产)。

1.2 模型制备 2017年6月—2018年9月在内蒙古自治区人民医院动物实验室进行实验，健康小鼠60只随机数字表法分为假手术组(Sham组)、肾脏缺血再灌注组(I/R组)和Klotho蛋白组各20只。 I/R组：1%戊巴比妥钠小鼠腹腔注射麻醉后，消毒铺布，沿腹正中线剪开并钝性分离暴露肾脏，采用小动脉夹对双侧肾蒂进行夹闭，肾脏颜色变暗红后计时35 min，35 min后将动脉夹移除，观察1 min内肾脏颜色渐变为鲜红，确定肾脏恢复灌注，缝合腹腔，进笼饲养。Sham组：小鼠同I/R组麻醉后，打开腹腔仅定位双侧肾蒂，但不夹闭，暴露肾脏35 min后，缝合腹腔入代谢笼饲养。Klotho蛋白组：手术方法同I/R组，手术时和术后2 h后在腹腔注射重组可溶性 Klotho 蛋白360 ng 1次。

1.3 观察指标与方法 手术24 h后收集各组小鼠血液和肾组织标本待测。

1.3.1 肾组织形态学观察：小鼠处死后，取肾脏组织并切成标本2块，经0.3 %戊二醛和1 %四氧化锇固定，梯度丙酮脱水后石蜡包埋、切片(厚度5 μm)，HE染色，镜下观察染色情况及组织轮廓。

1.3.2 肾功能检测： 小鼠麻醉后心脏穿刺取血，离心取上清液，全自动生化分析仪检测血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平。

1.3.3 肾组织Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白表达：(1)采用改良异硫氰酸胍法提取小鼠肾组织总蛋白，-70℃下冻存；(2)将总蛋白40 μg溶入等体积的缓冲液中煮沸10 min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离；(3)将蛋白质转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上；(4)NC膜置入封闭液中振荡封闭30 min，漂洗3次后加入一抗(Bcl-2、Bax、LC3及GAPDH抗体均为1∶1 000稀释， p62抗体为1∶500稀释)孵育，4℃下过夜。二抗孵育2 h，用免疫荧光增强法显色，采用Western-blot法检测肾组织Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白的表达(以GAPDH的灰度比值表示)[6]。

2 结 果

2.1 3组小鼠肾组织形态变化 Sham组小鼠肾小管结构清晰完整； I/R组肾组织损伤严重，肾小管上皮细胞刷状缘丢失、变性坏死，部分肾小管的管腔扩张，肾间质可见炎性细胞浸润；Klotho蛋白组小鼠肾小管损伤明显减轻，但部分小管仍有空泡变性(图1见封3)。

2.2 3组小鼠肾功能比较 与Sham组比较，I/R组和Klotho蛋白组SCr、BUN水平明显升高；与I/R组比较，Klotho蛋白组SCr、BUN水平降低 (P均<0.01)，见表1。

表1 3组小鼠肾功能比较

2.3 3组小鼠肾组织Bax、Bcl-2、p62及LC3蛋白表达比较 与 Sham组比较，I/R组及Klotho蛋白组Bcl-2和p62蛋白降低，Bax蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高；与I/R组比较，Klotho蛋白组p62和Bcl-2蛋白升高，Bax蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P均<0.01)，见表2。

3 讨 论

AKI是临床常见的以肾小球滤过率下降为特征的临床综合征[7]。统计数据显示，全球范围内每年因AKI而死亡的人数可到200万，在欧美国家AKI在入院患者中占3.2%～9.6%，其中1/5的入院患者死亡原因为AKI，甚至可占到ICU死亡患者的一半[8]。AKI的发病可受多种因素影响，包括肝衰竭、高血压、心力衰竭、败血症、血容量减少、药物及造影剂的使用等[9-10]。AKI是影响肾脏长期预后的独立危险因素，对AKI早期诊断及积极有效干预，有望改善其预后[11]。I/R是 AKI最常见的病因，缺血缺氧会增加血管通透性、激活缩血管物质并使血管促凝反应降低，对血管造成损伤并产生氧化应激，产生细胞毒性作用[12]。同时分泌大量黏附分子，与白细胞相互作用促进炎性介质的分泌，导致炎性细胞浸润肾组织，最终导致AKI[13]。目前I/R的分子机制研究已成为临床治疗AKI的热点[14-17]。

表2 3组小鼠肾组织相关蛋白表达水平比较

Klotho是一种抗衰老基因，有研究表明，Klotho 蛋白在I/R导致的AKI中起着重要作用[18]。I/R会产生大量的羟自由基、超氧自由基及过氧化氢等，超出抗氧化酶的清除能力，从而使肾组织产生明显的损伤[19-20]。本结果显示，I/R组肾小管刷状缘丢失，肾间质被炎性细胞浸润，肾组织损伤严重，肾小管上皮细胞刷状缘丢失、变性坏死，部分肾小管的管腔扩张，而通过补充Klotho蛋白可减轻肾小管的损伤，缓解肾小管坏死。本结果显示，Klotho蛋白组SCr、BUN水平明显低于I/R组(P<0.05)，这说明I/R组小鼠肾功能受损严重，Klotho 蛋白会促进MEK/ERK 通路磷酸化，使肾组织细胞凋亡明显减少，同时其具有抗氧化应激及抗炎性反应作用，可促进肾组织修复，尽快恢复肾功能[21]。

AKI过程中伴随着细胞死亡，而细胞死亡的3种常见表现为坏死、凋亡及自噬[22]。自噬是一种机体防御机制，是细胞胞浆内容物被包裹运送到溶酶体降解和再利用的一种代谢过程，其在AKI发生及发展过程中发挥重要作用[23]。大量研究证实自噬在肺病、神经退行性疾病及肾脏病等中起到重要作用[24]。受到缺血、缺氧、感染及药物等影响，自噬水平会上调[25]。本研究结果显示，Klotho蛋白组p62明显高于I/R组，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显低于I/R组(P<0.01)，表明了I/R小鼠的自噬水平明显增高，这是因为自噬水平增高会伴随LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换及p62的降解，而自噬体形成时LC3-Ⅰ蛋白可与磷脂酰乙醇胺相结合，从而形成LC3-Ⅱ蛋白；p62蛋白会选择性与LC3-Ⅱ结合，并被自噬体降解，所以I/R小鼠表现为LC3-Ⅱ升高和p62降低[26-27]。I/R损伤后会激活系列凋亡通路，其中促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2会对肾细胞的凋亡起到重要作用[28]。本结果显示，Klotho蛋白组Bcl-2蛋白明显高于I/R组，Bax蛋白表达明显低于I/R组(P<0.05)，这是因为Klotho蛋白具有抗凋亡作用，补充 Klotho 蛋白可以明显降低I/R小鼠的促凋亡蛋白Bax的表达水平，通过调节内质网应激，增高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，降低I/R损伤后细胞的早期凋亡率，从而使受损的肾小管上皮细胞尽快恢复。

综上所述，Klotho蛋白可延缓肾细胞损伤，起到肾保护作用，可为AKI的治疗提供新的作用靶点。

利益冲突：无

作者贡献声明

董丽娜:论文撰写,收集整理资料，分析数据，图表设计，参考书籍查找；赵晔、刘艾芹：资料搜集整理；于磊、刘国平：修改总指导