miR-218和Survivin基因/蛋白在喉癌中的表达及其与喉癌化疗敏感性的关系

要兆旭，冯志星，彭丽娜，韩海平，赫莉，杨雪

喉癌是头颈部较为常见的恶性肿瘤之一，多发于50～70岁男性。在我国，喉癌的发病率呈增长趋势，其治疗方法以手术切除为主，联合术前或术后化疗、放疗等综合治疗[1]。但由于个体差异大，化疗的疗效尚不确定，所以，如何选择合适的生物学指标预测化疗的疗效受到研究者们的重视。微小核糖核酸-218(miR-218)是一种小分子非编码RNA，在胃癌、结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达降低[2-4]，其低表达与肿瘤患者预后不良相关，可作为疾病诊治和预后判断的生物学指标。存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族中结构独特的新成员，具有较强的抗凋亡作用。研究发现，Survivin在膀胱癌、胃癌、食管鳞状细胞癌等肿瘤中升高[5-7]，参与肿瘤发生发展过程，是潜在的肿瘤治疗靶点[8]。下调Survivin表达可增强肿瘤细胞对化疗诱导的细胞凋亡敏感性[9]。有研究报道，miR-218可通过下调Survivin表达调控宫颈癌肿瘤细胞克隆形成、迁移和侵袭从而抑制宫颈癌的发展进程[10]。目前，miR-218是否也通过调控Survivin表达参与喉癌的发生和发展，以及二者表达与喉癌敏感性的相关研究还较少。本研究选取85例喉癌患者为研究对象，于治疗前取各患者喉癌活检组织标本，探讨miR-218和Survivin表达与喉癌化疗敏感性的关系，为喉癌化疗疗效的预测提供一定的理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年2月—2015年8月邯郸市中心医院耳鼻喉头部外科收治首次确诊为喉癌患者85例为研究对象，其中男68例，女17例，年龄30～85(63.17±8.25)岁；吸烟者54例，未吸烟者31例；肿瘤直径>3 cm者43例，≤3 cm者42例；按照TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期32例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；依据肿瘤分化程度：高分化26例，中分化35例，低分化24例；按照病理类型：鳞癌81例，腺癌4例；发生淋巴结转移者36例，未转移者49例。排除标准：(1)合并心脏、肾、肝等器官疾病患者；(2)合并糖尿病患者；(3)合并自身免疫疾病、精神病患者。以同期本院病理科30例正常喉黏膜组织石蜡切块作为对照，其中男23例，女7例，平均年龄(62.15±7.39)岁。本研究经医院伦理委员会批准，全部受试者知情同意并签署知情同意书。

1.2 实验试剂及仪器 Trizol试剂购自上海慧颖生物科技有限公司；反转录及PCR试剂盒购自日本Takara公司；免疫组化检测试剂均购自于武汉博士德公司。TP600型PCR 扩增仪购自日本 Takara公司；LC 480型Real-time PCR仪购自美国罗氏公司。

1.3 miR-218和Survivin mRNA表达检测 采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR)技术检测miR-218和Survivin mRNA表达，按照Trizol试剂说明书提取标本组织中总RNA，用DEPC处理过的超纯水溶解。分光光度计检测RNA溶液在260 nm和280 nm处吸光值(A)，计算RNA的浓度和纯度，A260/A280比值>1.8可用于检测miR-218和Survivin mRNA表达。将提取的总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增。miR-218上游引物5' -ACACTCCAGCTGGGTT-3' ，下游引物5' -TGGTGTCGTGGAGTCG-3' ；Survivin上游引物5' -AAGAGGCGGCAACAGATT-3' ，下游引物5' -GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3' ；U6上游引物5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ，下游引物5' -AACGCTTCACGAATTTG-3' ；β-actin上游引物5' -CCTGTACGCCAACACAGTGC-3' ，下游引物5' -ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3' 。反应条件：95℃预变性5 min后，95℃30 s， 60℃30 s，72℃30 s，总计40个循环。采用2-△△Ct法，分别以U6和β-actin为内参计算miR-218和Survivin mRNA相对表达水平。

1.4 Survivin蛋白表达检测 采用免疫组织化学法Envision二步法，严格按照产品操作说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。Survivin蛋白表达主要定位于细胞质，小部分定位于细胞核。随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞数和细胞总数。(1)按阳性细胞所占的百分比计分：<10%(0分)，10%～25%(1分)，26%～50%(2分)，>50%(3分)；(2)按染色强度计分：无色(0分)，淡黄色(1分)，棕黄色(2分)和棕褐色(3分)。取2项结果的乘积，≤3分为Survivin蛋白阴性表达，>3分为Survivin蛋白阳性表达。

1.5 化疗方法 喉癌组患者均于术后4～6周开始化疗，顺铂20～25 mg/m2静脉滴注，每天1次，共3 d；甲酰四氢叶酸钙100 mg静脉滴注，每天1次，共5 d； 5-氟尿嘧啶静脉滴注500～750 mg/m2，每天1次，共5 d；平阳霉素8 mg溶于20 ml生理盐水静脉注射，每天1次，共4 d。每月循环1次，共3个月。

1.6 疗效判断标准 根据改良的实体瘤疗效评价标准(mRECIST)进行疗效评估[11]，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。CR：所有目标病灶消失，无新病灶出现，肿瘤标志物水平正常，并维持4周；PR：所有目标病灶的长径总和减少≥30%，并维持4周；PD：所有目标病灶的长径总和增加≥20%，并且长径总和增加的绝对值超过5 mm，或者有新病灶出现，或者病灶数量增加；SD变化介于PR和PD之间。术后辅助化疗敏感类包括CR和PR患者，不敏感类包括SD和PD患者。

2 结 果

2.1 miR-218和Survivin mRNA表达比较 qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，喉癌组织中miR-218表达显著降低(1.06±0.18 vs. 0.62±0.17，t=12.003,P<0.01)，Survivin mRNA表达显著升高(1.08±0.21 vs. 1.72±0.24，t=12.953,P<0.01)，见图1。

注：与对照组比较，aP<0.01

图1 喉癌组织与正常喉组织miR-218和Survivin mRNA表达比较

2.2 Survivin蛋白表达比较 免疫组化结果显示Survivin主要定位于细胞质，胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性反应，喉癌组阳性颗粒较多，对照组则阳性表达很少(图2见封3)。喉癌组织中Survivin蛋白阳性表达率为45.88%(39/85)，对照组Survivin蛋白阳性表达率为16.67%(5/30)。与对照组比较，喉癌组织中Survivin蛋白阳性表达率显著升高(χ2=8.012,P<0.05)。

2.3 miR-218和Survivin mRNA表达与喉癌患者临床病理特征的关系 以喉癌组患者 miR-218和Survivin mRNA表达的平均数0.31、 0.86为分界点，将85例患者分为miR-218低表达组42例、miR-218高表达组43例；Survivin低表达组46例、Survivin高表达组39例。miR-218和Survivin mRNA表达均与肿瘤直径大小、TNM分期、分化程度及淋巴结是否转移相关(P<0.05)，而与喉癌患者性别、年龄、是否吸烟及病理类型无关(P>0.05)，见表1。

2.4 miR-218和Survivin mRNA表达的相关性 生物信息学分析发现，癌基因Survivin是miR-218的下游潜在作用靶点之一[12]。Spearman相关性分析结果显示，喉癌组织中miR-218和Survivin mRNA表达呈明显负相关(r=-0.534，P<0.05)，见图3。

注：A.miR-218和Survivin mRNA互补序列；B.喉癌组织中miR-218和Survivin mRNA表达相关性

图3 miR-218和Survivin mRNA表达相关性

2.5 miR-218和Survivin mRNA表达与喉癌化疗敏感性的关系 经过3个月治疗后，CR、PR、SD和PD患者分别有20例、41例、17例和7例。miR-218高表达患者中对化疗敏感人数占总化疗敏感人数的59.02%，低表达患者占40.98%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。Survivin高表达患者中对化疗敏感人数占总化疗敏感人数的37.70%，低表达患者占62.30%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。与化疗不敏感患者相比，化疗敏感患者miR-218表达显著升高(P<0.05)，Survivin表达显著降低(P<0.05)，见表2、图4。

注：与化疗不敏感患者比较，aP<0.05

3 讨 论

喉癌是常见的影响患者健康的头颈部恶性肿瘤。化疗在恶性肿瘤的治疗中起重要作用，化疗疗效依赖于肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性[13]。导致化疗失败的原因比较复杂，涉及到多种机制，如某些影响细胞生长、凋亡的基因分子可影响肿瘤化疗的敏感性[14]。寻找准确、快速和灵敏的生物学指标预测不同喉癌患者对化疗的敏感性，依据化疗敏感性的不同制定不同的化疗方案，使患者从中受益意义重大。

miRNA是一类内源性非编码小RNA，通过转录后水平调控RNA表达，参与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为的调控过程。近年来研究表明，miR-218作为基因表达调控因子，与肿瘤的发生、发展密切相关。Wang等[15]研究发现，胃癌组织中miR-218表达水平显著低于癌旁组织，其低表达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度及淋巴结是否转移密切相关，miR-218低表达患者5年总生存率明显低于高表达患者，可作为胃癌患者的预后生物标志物。Zhang等[16]研究发现，喉鳞状细胞癌组织miR-218表达显著低于相邻正常组织，其过表达可显著抑制喉鳞状癌细胞的增殖和侵袭，是喉鳞状细胞癌患者潜在的治疗靶点。本研究结果显示，喉癌组织中miR-218表达水平较对照组显著降低，miR-218低表达与肿瘤直径大小、TNM分期、分化程度和淋巴结转移关系密切，提示miR-218表达在喉癌的发生发展过程中起重要作用。化疗敏感的患者miR-218表达水平显著高于化疗不敏感患者，提示miR-218表达越高，对化疗敏感性越强，疗效越好。

准确预测miRNA的靶基因并正确认识 miRNA及其靶基因的相互作用是研究miRNA在疾病中作用机制的关键[17-20]。生物信息学分析发现，Survivin是miR-218的靶基因，miR-218可通过下调Survivin表达抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等。农朝赞等[21]研究发现，转染miR-218的人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖受到抑制，Survivin蛋白表达降低，miR-218可能通过下调Survivin表达诱导鼻咽癌细胞凋亡。万军等[12]研究发现，食管癌组织miR-218表达显著降低，Survivin表达显著升高，miR-218转染人食管癌TE-1细胞后，可显著降低细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平，提示食管癌中miR-218可能通过下调Survivin表达发挥抗肿瘤作用。Survivin是抗凋亡家族蛋白中抗凋亡作用最强的因子，可促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、影响肿瘤血管生成等。Shi等[22]研究发现喉鳞状细胞癌组织Survivin mRNA表达较癌旁组织显著升高，Transwell侵袭实验结果表明，过表达Survivin可显著提高Hep-2细胞的相对存活率。Wen等[23]研究发现，转染p-siRNA survivin后的喉癌Hep-2细胞增殖明显受到抑制，抑制率高达79%，流式细胞术显示Survivin沉默可显著抑制体外和体内Hep-2的生长并诱导其凋亡。本研究结果显示，喉癌组织中Survivin mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著升高，Survivin mRNA高表达患者肿瘤直径大、TNM分期高、分化程度低及淋巴结发生转移，提示Survivin参与喉癌的发生发展过程，是潜在的治疗靶点。化疗敏感的患者Survivin mRNA表达水平显著低于化疗不敏感患者，提示Survivin表达水平越低，对化疗敏感性越强，疗效越好。相关性分析结果显示，喉癌组织miR-218和Survivin mRNA呈明显负相关，提示喉癌组织中miR-218可能也通过下调Survivin表达抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。

表1 miR-218和Survivin mRNA表达与喉癌患者临床病理特征关系

表2 miR-218和Survivin表达与化疗敏感性分析 [例(%)]

综上所述，喉癌组织中miR-218和Survivin均表达异常，与喉癌化疗敏感性相关，可作为预测化疗疗效的生物学指标。喉癌组织中miR-218可能通过调控Survivin表达参与肿瘤发生和发展过程。但是，喉癌中miR-218具体如何调节Survivin表达发挥作用，调控的信号通路如何，还有待进一步深入研究。

利益冲突：无

作者贡献声明

要兆旭：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；冯志星：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；彭丽娜、韩海平：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；赫莉：进行统计学分析；杨雪：课题设计，论文撰写