基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱技术的复方菝葜体外物质基础研究

何丹 黄小龙 陈林 梁雪娟 朱立华 张水寒

摘要：目的  采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS）技术分析复方菝葜化学成分。方法  色谱柱为Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，流动相为甲醇-0.1%甲酸水，梯度洗脱;采用电喷雾离子源在负离子模式下采集数据，通过质谱信息、文献检索及中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）对各成分进行解析，并进行初步药材归属。结果  从复方菝葜提取物中共解析出29个成分，主要包括酚酸类、黄酮类、脂肪酸类、三萜类、香豆素类等成分，部分化合物获得初步药材归属。结论  采用HPLC-Q-TOF-MS技术能准确、高效鉴定复方菝葜各组成成分，为其药效学研究及质量控制提供依据。

关键词：复方菝葜;高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱;酚酸;黄酮

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）11-0068-06

Abstract： Objective To analyze the chemical compositions of compound Smilacis Chinae Rhizoma through high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS）. Methods HPLC used ultimate AQ-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）; detection wavelength was 280 nm; gradient elution with methanol-water （containing 0.1% formic acid） as mobile phase and flow rate of 0.6 mL/min; column temperature was 25 ℃; the injection volume was 5 μL. Data was acquired in negative ion mode using ESI. Each composition was analyzed by mass spectrometry information， literature search， and TCM System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）. Preliminary attribution of Chinese materia medica was conducted. Results A total of 29 compositions were analyzed from the compound Smilacis Chinae Rhizoma， including phenolic acids， flavonoids， fatty acids， triterpenoids， coumarins， etc.， and each composition has preliminary attribution of Chinese materia medica. Conclusion HPLC-Q-TOF-MS technology can be used to identify the compositions of compound Smilacis Chinae Rhizoma， which provides references for its pharmacodynamic study and quality control.

Keywords： compound Smilacis Chinae Rhizoma; high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry; phenolic acids; flavonoids

复方菝葜颗粒（国药准字B20020355）由菝葜、鱼腥草、猫爪草、款冬花、枸杞子、大枣（去核）、土鳖虫、鲜鳢鱼组成，具有清热解毒、软坚散结、滋阴益气功效，可用于改善肺癌、子宫颈癌伴有咳嗽、胸痛、带下异常等症状，是治療肺癌的复方制剂。复方菝葜颗粒配合放疗、化疗或手术等治疗癌症，可缓解患者痛苦，起到增效减毒的作用;对于晚期失去手术机会的患者，可明显改善临床症状，提高患者生存质量，延长生存期[1]。

高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS）技术作为一种体外物质基础研究手段，具有分辨率高、效率高、灵敏度高、准确性强等优势，较传统分离分析技术可明显缩短分析周期，尤其适用于复杂组分的成分分析，全面阐明中药组成，有利于整体把握复方物质基础，目前已广泛应用于中药及复方制剂成分分析[2-3]。中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/tcmsphp）以《中华人民共和国药典》为核心，整合了499种中草药，收纳29 000余种化学成分，可用于中药及复杂成分的发现与开发[4]。

本研究利用HPLC-Q-TOF-MS技术对复方菝葜的化学成分进行检测分析，联合文献调研和TCMSP对各成分进行初步归属和类别归纳，为复方菝葜颗粒的药效学研究和质量控制提供依据。

1  仪器与试药

安捷伦1290 Infinity型高效液相色谱系统（配有四元泵及在线脱气、紫外检测器、6530 Q-TOF质谱仪），安捷伦科技公司;AL204型十万分之一电子分析天平，梅特勒-托利多公司;KM-500DB型超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司。

试验样品均购自湖南永康堂大药房连锁有限公司，经湖南省中医药研究院中药研究所刘浩助理研究员鉴定，菝葜（批号2017110101）为百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，鱼腥草（批号18110501）为二白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分，猫爪草（批号18053002）为毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根，枸杞子（批号18120902）为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarm L.的干燥成熟果实，大枣（批号20180101）为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实，款冬花（批号180901）为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，土鳖虫（批号20161006）为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳖Steleophaga plancyi（Boleny）的雌虫干燥体。

落新妇苷对照品（批号1DBG-QHTR，HPLC纯度≥98%），中国食品药品检定研究院;金丝桃苷对照品（批号CHB160904，HPLC纯度≥98%）、3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号CHB171013，HPLC纯度≥98%）、3，4-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号CHB160725，HPLC纯度≥98%）、4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号CHB160726，HPLC纯度≥98%），成都克洛玛生物科技有限公司。甲酸和甲醇均为色谱纯，美国TEDIA公司;其余试剂均为分析纯;水为纯净水，华润怡宝饮料（长沙）有限公司。

2  方法

2.1  样品制备

精密称取菝葜、鱼腥草、猫爪草、枸杞子、大枣（去核）各150 g，款冬花、土鳖虫各50 g，鲜鳢鱼90 g。第1次加3760 mL水，煎煮1.5 h，第2次加2820 mL水，煎煮1 h，合并煎液，浓缩，冷冻干燥仪干燥，得浸膏，备用。取5 g复方菝葜浸膏，溶于20 mL水分散，石油醚（每次40 mL）萃取至下层无色，下层继续用乙酸乙酯（每次40 mL）萃取4～5次，合并上层溶液，浓缩，蒸干，用甲醇复溶至10 mL。

2.2  色谱条件

色谱柱为Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～20%A;10～17 min，20%～25%A;17～19 min，25%～25%A;19～21 min，25%～28%A;21～35 min，28%～30%A;35～42 min，30%～36%A;42～50 min，36%～39%A;50～70 min，39%～44%A;70～80 min，44%～95%A;80～90 min，95%～95%A）。

2.3  质谱条件

电喷雾离子源（ESI），负离子模式扫描，毛细管电压4 000 V，离子源温度350 ℃，雾化器压力276 kPa，干燥器体积流量6 L/min，锥孔65 V，干燥器温度350 ℃，碎片电压135 V，质量数扫描范围m/z 100～1000，采样频数0.1 s、间隔0.02 s，碰撞能量分别采用10、15 eV。测量样品前使用调谐液校准质量轴，以降低质量精准度误差。

3  结果

从复方菝葜提取物中共获得29个化合物，分别为：6个脂肪酸类、11个酚酸类、7个黄酮类、2个三萜类、1个香豆素类。基峰图见图1。将保留时间（tR）、质谱信息结合对照品、相关文献及TCMSP数据进行化学成分指认和初步药材归属，结果见表1。

3.1  脂肪酸类

共鉴定6个已知的脂肪酸，负离子模式下产生[M-H]-的分子离子峰具体为：琥珀酸（峰1）m/z 117.018 5，壬二酸（峰18）m/z 187.096 8，棕榈酸（峰28）m/z 255.232 8，亚油酸（峰24）m/z 20.217 3，亚麻酸（峰25）m/z 279.232 6，11-十八碳烯酸（峰29）m/z 281.248 1。前3个成分为饱和脂肪酸，后3个成分为不饱和脂肪酸。这些通常以羧基部分失去H2O和CO2形成的碎片离子为主，其中多不饱和脂肪酸及一些单不饱和脂肪酸的质谱特征还在于出现一系列以14 m/z为基本单位分开的离子峰，可通过切割脂肪酸链中的连续C-C单键定位不饱和脂肪酸双键的位置。故峰24、25、29还分别出现了m/z 209[M-H-C5H10]-、m/z 249[M-H-C2H4]-、m/z 197[M-H-C6H12]-用作分子中存在雙键的指示剂，裂解途径与文献报道[5]一致。以11-十八碳烯酸为例，其碎片离子及结构见图2。

图2  11-十八碳烯酸二级碎片离子图

3.2  酚酸类

峰3、4、5的tR分别为12.084、14.453、16.905 min，负离子模式下生成的[M-H]-准分子离子峰分别为m/z 167.033 8、m/z 153.018 6和m/z 137.023 5;均检测到失去CO2的特征碎片离子[M-H-CO2]-，分别为m/z 123、m/z 109、m/z 93，根据元素组成分析，三者对应的分子式分别为C8H8O4、C7H6O4、C7H6O3，其相对分子质量分别为168、155和138，推测峰3、4、5可能分别为香草酸、原儿茶酸和对羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸的碎片离子及结构见图3。峰7在峰5基础上还检测到m/z 137[M-H-CH3]-的碎片离子，根据其元素组成分析，该化合物分子式为C8H803，推测该成分为对羟基苯甲酸甲酯。峰11、12的tR分别为20.692、34.039 min，峰11的质谱信息检测到离子对m/z 179.034 6[M-H]-和m/z135[M-H-CO2]-，峰12号的质谱信息检测到离子对m/z 163.039 3[M-H]-和m/z 119[M-H-CO2]-，根据二者元素组成为C9H8O4、C9H8O3，分别推测为咖啡酸和对香豆酸。以上质谱信息与文献报道[6-7]一致。