紫草素影响Let-7c的表达调控宫颈癌细胞C-33A生物学特性的研究

文 蓉，李树玺

(1.无锡市妇幼保健院妇产科,江苏无锡 214000;2.葛洲坝集团中心医院检验科,湖北宜昌 443000)

宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势，对患者的健康和生命造成严重的影响[1]。目前对宫颈癌的治疗主要以外科手术、放疗和化疗，但放疗和化疗的毒副作用极大，对患者身心造成严重的危害[2]。因此，寻找高效、毒副作用较小的药物和治疗方法是治疗宫颈癌迫切需要解决的问题。紫草素是天然植物紫草根中的主要有效成分，具有广泛的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理功效[3]。目前的研究显示，紫草素能够显著抑制喉癌、大肠癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制肿瘤发展，有抗癌作用[4-5]。多项研究表明，紫草素具有良好的抑制宫颈癌细胞生长的作用，且能够抑制裸鼠移植瘤的生长[6-8]。微小RNA(miRNA)是一种在进化上高度保守的长度约为21个核苷酸的非编码RNA，在肿瘤的发生和发展过程中具有至关重要的作用[9-10]。研究表明Let-7c在肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭的功能，发挥抗癌作用[11-13]。研究显示，Let-7c在宫颈癌细胞中呈低表达，而在正常细胞中呈高表达[14]，提示其可能参与宫颈癌的发生和发展。本研究首次探讨了中药紫草素可能通过影响Let-7c的表达来调控细胞增殖、迁移和侵袭等过程，为中药治疗宫颈癌的分子机制研究提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本 为本院2016年8月至2018年12月妇产科经病理学确认的人宫颈癌组织以及对应正常宫颈组织标本各25例，标本采集经所有患者及家属知情同意。本研究已经本院伦理会审核并批准。

1.1.2细胞株 宫颈癌细胞株C-33A及正常宫颈细胞株Ect1/E6E7购于中国科学院上海生命科学院细胞库。

1.1.3实验动物 40只雌性健康SPF级BALB/c-nu裸鼠，体质量17～22 g，5～7周龄，购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器 酶联免疫检测仪购自美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司；倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司；流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.2.2主要试剂 紫草素购自中国药品生物制品检定所，纯度≥99%；Trizol提取试剂盒、反转录试剂盒购自碧云天生物技术研究所；实时荧光定量PCR检测2×SYBR Green Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司；实验所用引物均有上海生工生物工程股份有限公司合成；Let-7c mimics、mimics control、Let-7c inhibitor、inhibitor control均购自上海吉玛制药技术有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Matrigel购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.3方法

1.3.1qPCR检测 使用Trizol法提取宫颈癌组织及正常宫颈组织和宫颈癌细胞株C-33A及正常宫颈细胞株Ect1/E6E7中总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录反应合成cDNA。以合成cDNA为模板采用2×SYBR Green Master Mix检测试剂盒进行荧光定量PCR扩增。以U6为内参，采用相对定量2-△△CT分析Let-7c的相对表达水平。

1.3.2细胞分组和转染 宫颈癌C-33A细胞接种于含10%FBS的DMEM培养基(含100 g/L青霉素和100 g/L链霉素)中，置于CO2体积分数为5%湿度为95%的37 ℃培养箱中培养。每隔1 d换液一次，待细胞生长汇合度达90%时用胰蛋白酶消化传代，取处于对数生长期的细胞用于转染。转染前24 h更换成不添加抗生素的培养基培养，将细胞接种于6孔板中，继续培养约12 h，当细胞生长汇合度至40%～60%时采用LipofectamineTM2000转染试剂进行细胞转染。转染操作步骤参照转染试剂说明书进行。将转染Let-7c mimics的C-33A细胞记为Let-7c组，将转染Let-7c inhibitor的C-33A细胞记为anti-Let-7c组，将转染其阴性对照mimics control的C-33A细胞记为对照组。转染后的C-33A细胞置于37 ℃培养箱中继续培养。转染24 h后，以终浓度为40 μmol/L的紫草素处理anti-Let-7c组细胞，记为anti-Let-7c+紫草素组。

1.3.3MTT法检测宫颈癌C-33A细胞增殖能力 采用MTT法检测不同处理的宫颈癌细胞增殖能力，即在待测每孔细胞中加入浓度为5 g/L MTT 10 μL，置于37 ℃培养箱中继续培养3 h，除去上清液，每孔细胞中加人150 μL DMSO，于震荡仪上避光震荡至结晶紫完全溶解，在酶标仪上492 nm处测定各孔细胞吸光度值(A值)。以时间为横轴，测得的A值为纵轴，绘制细胞生长曲线，观察细胞增殖情况。

1.3.4Transwell实验检测宫颈癌细胞迁移和侵袭能力 用无血清的培养基稀释Matrigel胶，铺于Transwell小室的上室中，每孔40 μL，将小室置于24孔板中，在37 ℃培养箱中静置，待基质胶完全风干后取出。将待检测的各组C-33A细胞饥饿处理24 h，用胰酶消化并收集细胞，以无血清培养液重悬细胞，制成浓度为2×105/mL的单细胞悬液。在Transwell小室的上室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含10%FBS的培养基，37 ℃培养箱中继续培养48 h。取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去未侵袭的细胞，以甲醇固定10 min，结晶紫染色15 min，洗涤后晾干，在倒置显微镜下随机选取5个视野进行拍照，计数。以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。以同样的方法检测细胞迁移能力，不同之处在于所用的Transwell小室的上室不加Matrigel基质胶涂层。

1.3.5裸鼠体内移植瘤实验 取对数生长期的宫颈癌C-33A细胞接种到新鲜培养基中，继续培养24 h，将细胞浓度调整为1×106/mL的单细胞悬液，分别取0.2 mL细胞悬液接种于40只雌性健康SPF级BALB/c-nu裸鼠右侧颈背部皮下。将接种的裸鼠随机分为4组，每组10只，分别为对照组、anti-Let-7c组、紫草素组和anti-Let-7c+紫草素组。裸鼠接种癌细胞24 h后，对照组采用瘤体内注射同体积生理盐水；anti-Let-7c组采用瘤体内注射Let-7c inhibitor质粒10 mg/(kg·d)；紫草素组瘤体内注射40 μmol/L紫草素10 mg/(kg·d)；anti-Let-7c+紫草素组瘤体内注射Let-7c inhibitor质粒及40 μmol/L紫草素10 mg/(kg·d)。连续处理28 d后处死裸鼠，测量肿瘤质量。

2 结 果

2.1qPCR检测Let-7c在不同组织和细胞中的表达情况 采用qPCR检测Let-7c在宫颈癌组织、正常宫颈组织、宫颈癌C-33A细胞及正常宫颈细胞(Ect1/E6E7细胞)中的表达水平。与正常宫颈组织Let-7c的相对表达水平(1.035±0.109)相比，宫颈癌组织(0.257±0.046)中Let-7c的表达水平显著降低，差异有统计学意义(t=20.795，P<0.05)。与正常宫细胞的Let-7c表达水平(0.993±0.059)相比，宫颈癌C-33A细胞(0.334±0.034)的Let-7c表达水平明显降低，差异有统计学意义(t=30.603，P<0.05)，见图1。

注：与正常宫颈组织或细胞比较，*P<0.05

2.2紫草素对宫颈癌C-33A细胞增殖、侵袭和迁移的影响 用不同浓度的紫草素(10、20、40、60、80 μmol/L)干预C-33A细胞，在干预6、12、24、48 h后分别通过MTT法检测细胞增殖情况。随着紫草素浓度的升高，对C-33A细胞增殖抑制作用增强，在干预24 h时40 μmol/L的紫草素可显著抑制细胞生长，因此选择浓度为40 μmol/L的紫草素用于后续研究，见图2A。通过Transwell实验检测紫草素对C-33A细胞迁移和侵袭的影响，见图2B、2C，与对照组(91.4±3.534和100.8±3.707)相比，紫草素组C-33A细胞(33.6±5.335和32.4±5.115)的迁移和侵袭能力明显下降，差异有统计学意义(F迁移=15.644，F侵袭=18.754，均P<0.05)。提示紫草素有够抑制宫颈癌C-33A细胞增殖、迁移和侵袭的能力。

注：A为MTT法检测紫草素对C-33A细胞增殖能力；B为Transwell实验检测紫草素对C-33A细胞迁移能力；C为Transwell实验检测紫草素对C-33A细胞侵袭能力；*表示与对照比较，P<0.05

2.3紫草素对C-33A细胞中Let-7c表达的影响 为探究紫草素对Let-7c表达的影响，本实验通过不同浓度的紫草素干预C-33A细胞24 h，通过qPCR检测细胞中Let-7c的表达情况。结果显示，与浓度为0 μmol/L紫草素干预组(0.982±0.064)相比，浓度在20 μmol/L以上的紫草素干预可显著促进细胞中Let-7c的表达，且呈浓度依赖性增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。说明紫草素能够促进C-33A细胞中Let-7c的表达。

2.4过表达Let-7c对宫颈癌C-33A细胞增殖、侵袭和迁移的影响 MTT法检测C-33A细胞转染Let-7c mimics后1、2、3、4、5 d后细胞增殖情况，见图4A。与对照组细胞比，Let-7c组细胞增殖能力显著降低，差异有统计学意义(t2 d=5.282,t3 d=4.849,t4 d=3.899，t5 d=3.642，P<0.05)。通过Transwell实验检测转染Let-7c mimics后对C-33A细胞侵袭和迁移能力的影响，见图4B和4C。与对照组细胞比较，Let-7c组细胞侵袭和迁移能力均显著下降，差异有统计学意义(t迁移=19.473，t侵袭=16.127，P<0.05)。提示，上调Let-7c的表达能够显著抑制宫颈癌C-33A细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

注：*表示与0 μmol/L紫草素比较，P<0.05

注：A为MTT法检测各组C-33A细胞增殖能力；B为Transwell实验检测C-33A细胞迁移能力；C为Transwell实验检测C-33A细胞侵袭能力；与对照组比较，*P<0.05

2.5紫草素通过影响Let-7c的表达调控C-33A细胞增殖、迁移和侵袭能力 为研究紫草素通过调节Let-7c的表达影响宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，本课题组在C-33A细胞中转染Let-7c inhibitor 24 h后用浓度为40 μmol/L的紫草素处理细胞，经MTT法检测处理1、2、3、4、5 d后细胞的增殖能力，见图5A。与anti-Let-7c组细胞相比，anti-Let-7c+紫草素组细胞增殖能力降低，差异有统计学意义(F2 d=15.266,F3 d=11.723,F4 d=18.740，F5 d=16.748，P<0.05)，提示紫草素能够回调由转染Let-7c inhibitor导致的细胞增殖能力升高的现象。Transwell实验检测结果显示，与anti-Let-7c组细胞相比，anti-Let-7c+紫草素组细胞迁移和侵袭能力均下降，差异有统计学意义(F迁移=69.467，F侵袭=75.039，P<0.05)，提示紫草素能够回调由anti-Let-7c导致的细胞迁移和侵袭能力升高的现象。

注：A为MTT法检测各组C-33A细胞增殖能力；B为Transwell实验检各组C-33A细胞迁移能力；C为Transwell实验检测各组C-33A细胞侵袭能力；与anti-Let-7c组比较，*P<0.05

2.6紫草素通过调节Let-7c表达对小鼠移植瘤质量的影响 为进一步研究紫草素通过调节Let-7c的表达对宫颈癌细胞的影响，本实验在SPF级BALB/c-nu裸鼠体内接种宫颈癌C-33A细胞，经不同处理观察对移植瘤的影响，见图6。与对照组裸鼠的移植瘤质量比较[(0.772±0.098)g]，anti-Let-7c组裸鼠移植瘤质量[(1.095±0.118)g]升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与紫草素组裸鼠[(0.282±0.081)g]相比，anti-Let-7c+紫草素组裸鼠移植瘤质量[(0.534±0.073)g]升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与anti-Let-7c组裸鼠相比，anti-Let-7c+紫草素组裸鼠移植瘤质量显著降低，差异具有统计学意义(F=40.665,P<0.05)。说明紫草素可回调anti-Let-7c对肿瘤生长的促进作用，提示紫草素能够通过促进Let-7c的表达抑制移植瘤的生长。

注：*表示P<0.05

3 讨 论

近年来，天然药物在肿瘤治疗中发挥重要的作用，目前已引起国内外广大研究者的广泛关注[15]。寻求新的天然抗癌药物以及药物抗癌作用靶点成为癌症治疗研究的发展方向。紫草素是从天然中药紫草中提取的一种萘醌类化合物，具有良好的抗癌效果[16]。紫草素能够在体外抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖，并通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达诱导SKOV-3细胞发生凋亡[17]。紫草素可通过调节凋亡相关PI3K/PKB信号通路促进子宫内膜癌HEC-1B细胞凋亡，抑制细胞增殖[18]。体外培养人胃癌SGC-7901细胞，以不同浓度的紫草素作用SGC-7901细胞后，胃癌SGC-7901细胞侵袭、迁移能力降低，qPCR检测MMP-2、MMP-7 mRNA的表达，发现二者的表达显著下调，提示紫草素通过下调MMP-2、MMP-7的表达抑制胃癌SGC-7901细胞的侵袭和迁移[19]。紫草素能够呈浓度依赖性抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖、侵袭和迁移，其作用机制与抑制FAK信号通路活化有关[20]。提示紫草素能够通过调控多种分子及信号通路发挥抗癌作用。本实验在体外培养宫颈癌C-33A细胞，以不同浓度的紫草素作用于C-33A细胞，在作用的不同时间点检测细胞增殖情况，结果显示，随着紫草素作用浓度的增加，对C-33A细胞增殖抑制作用逐渐增强，呈现出一定的浓度依赖关系。Transwell实验结果显示，紫草素同样可以抑制宫颈癌C-33A细胞的迁移和侵袭。提示紫草素能够抑制宫颈癌C-33A细胞的增殖、侵袭和迁移，具有抗癌作用，与上述研究相符。此外，本研究还发现，紫草素干预C-33A细胞后Let-7c的表达量显著升高，这提示紫草素对宫颈癌细胞生物学特性的调控可能与影响Let-7c的表达有关。

Let-7c最早是在线虫中发现的，是线虫发育过程中关键的调节因子[21]。let-7家族成员的成熟形式在物种间高度保守，它编码13个同源miRNA位于人类癌症中经常缺失的基因组位置[22]。据报道，Let-7c的上调能够抑制肺癌和前列腺癌细胞的生长，并可减少乳腺癌细胞的转移[23-25]。然而，Let-7c在宫颈癌C-33A细胞的恶性生物学行为中的作用仍有待进一步阐明。本研究首先检测了宫颈癌组织和正常宫颈组织中Let-7c的表达，发现Let-7c在宫颈癌组织中呈低表达，与MALTA等[14]的研究一致，而且在宫颈癌细胞的表达较正常宫颈细胞低，这说明Let-7c与宫颈癌有一定的相关性，具有一定的研究价值。此外，本研究上调C-33A细胞中Let-7c的表达后，细胞增殖、侵袭和迁移能力均显著降低，说明Let-7c发挥抑制宫颈癌的作用。为探究紫草素对Let-7c表达的影响，本研究的qPCR检测结果显示，紫草素能够促进Let-7c的表达，且具有一定的浓度依赖性。为进一步探究紫草素通过影响Let-7c的表达调控宫颈癌细胞生物学特性，本研究转染Let-7c inhibitor后施加紫草素，观察对细胞的影响，结果显示，紫草素能够逆转由Let-7c下调引起的增殖、侵袭和迁移能力的升高。此外，本研究建立宫颈癌C-33A细胞小鼠移植瘤实验，研究紫草素治疗肿瘤的效果。结果发现与单纯注射紫草素的裸鼠移植瘤相比，同时注射Let-7c inhibitor和紫草素的裸鼠移植瘤质量显著增加。与单纯注射Let-7c inhibitor的裸鼠移植瘤相比，同时注射Let-7c inhibitor和紫草素的裸鼠移植瘤质量显著降低，提示紫草素可回调anti-Let-7c对肿瘤生长的促进作用。进一步验证了紫草素通过影响Let-7c的表达起到抗肿瘤作用。

4 结 论

紫草素对宫颈癌C-33A细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用与下调Let-7c的表达有关。提示Let-7c很可能是紫草素调控宫颈癌细胞生物学特性的药理靶点之一。