HPLC法分析覆盆子多糖单糖组分的研究

朱会霞，孙金旭，孙 浩

(衡水学院，河北 衡水 053000)

覆盆子(Raspberry)又名大号角公，覆盆子果实中糖的含量大约为2.40%～10.67%，有机酸的含量大约为0.62%～4.09%，同时还含有维生素B族，维生素C，烟酸及17种人体必需氨基酸[1-2]。

单糖本身不会吸收紫外光，这是采用HPLC分析单糖组成时遇到的最大难点，所以只有使它在紫外区具有吸收才能进行分析，这就需要对单糖进行衍生化，但衍生化所使用的试剂的选择和色谱分析的条件都是很困难的。所以，利用衍生化HPLC测定单糖这个方法到现在还在不断的研究和完善中[3-4]。本实验主要运用示差折光检测器来操作，然后把分离度和峰型作为评价标准，选取色谱柱、流动相的组成等色谱条件，最后确定适用单糖HPLC分析的色谱条件。建立了适合覆盆子多糖中单糖组成测定的HPLC新方法。这种方法不需要进行糖的衍生化步骤，也不需要减少单糖测定的处理环节，而且可以准确迅速地达到目标。

1 材料与方法

1.1 材料

覆盆子(购于衡水市中医院药店)。

1.2 仪器与试剂

HPLC(Agilent 1100大连三杰科技发展有限公司)配紫外检测器；组织捣碎机 XA-1(金坛市开发区吉特实验仪器厂)；分光光度计 UV-250(日本岛津) 色谱柱：C18柱(安捷伦C18标准柱)。

葡萄糖(Glc)；半乳糖(Gal)；果糖(Flu)；甘露糖(Man)；鼠李糖(Rha)；阿拉伯糖(Ara)；PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)购于国家标准物质网，其它试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 覆盆子多糖的提取

图1 覆盆子多糖提取工艺流程

1.3.2 覆盆子多糖的水解

称取一定量的经1.3.1提取的覆盆子多糖，加入TFA溶液2 mL(浓度2 mol/L)，封口，摇匀，100℃下，水解6 h，冷却至室温后，经1000 r/min离心5 min后，取上清液，NaOH中和至中性，真空冻干后备用。

1.3.3 PMP衍生化产物的制备方法

1.3.3.1 单糖标准品混合物的衍生物制备

称取一定量的单糖标准品，分别配置成0.2 mol/L的单糖标准溶液，取80 μL的单糖标准品放于同一试管中，混匀后，分别加入100 μL 浓度为0.3 mol/L的NaOH和1.2 mL浓度为0.5 mol/L的PMP的甲醇溶液，摇匀，在70℃的水浴环境中反应40 min后冷却至室温，加入稀盐酸中和至中性，用CHCl3萃取5次，水相为PMP衍生物。

1.3.3.2 覆盆子多糖水解产物PMP衍生物的制备

将经1.3.2处理后的覆盆子多糖水解产物按1.3.3.1的方法进行处理后即为覆盆子多糖水解产物PMP衍生物。

1.3.4 单糖标品及覆盆子多糖HPLC测定条件

流动相：100 mmol/L醋酸胺缓冲溶液(pH值5.5)/乙腈(体积比为78∶22)，等度洗脱，流速1 mL/min；紫外检测波长：245 nm；进样量：10 μL；柱温：室温。

1.3.5 单糖定量计算[5]

1.3.5.1 校正因子fi/s

式中：fi/s校正因子；

mi标准混合液中单糖量(mol)；

ms内标单糖的量(mol)；

Ai标准混合液中单糖峰面积；

As内标单糖峰面积。

1.3.5.2 摩尔比例计算

式中：Ri/s摩尔比例；

fi/s校正因子；

Ai标准混合液中单糖峰面积；

As内标单糖峰面积；

M单糖分子量。

1.3.6 相对标准偏差计算

相对标准偏差计算公式如(3)、(4)、(5)所示：

1.3.7 回收率计算

回收率计算公式如下：

式中：(A:回收率；W：原覆盆子多糖中各单糖含量，μmol；Z：加标量，μmol；E：加标后测定混合液中各单糖含量，μmol)

2 结果与讨论

2.1 单糖标品HPLC色谱图

在设定的HPLC条件下，进样混合单糖标品，在流动相流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的条件下分别进行进样，已达到良好分离效果的目的，结果如图2、3所示。

图2 混合单糖标准品PMP水解衍生色谱图

图3 覆盆子多糖水解衍生色谱分析图

如图2所示，经试验研究发现，在流动相流速为1.5 mL/min条件下，单糖混合标样能够达到较好的分离效果，各个单糖标样出峰效果较好，因此确定流动相流速1.5 mL/min为适宜。

2.2 方法性能分析

2.2.1 单糖标准品曲线方程

分别吸取各单糖标准品溶液，经衍生处理后，进行梯度稀释，HPLC测定，以响应的单糖浓度为横坐标，对应的HPLC峰面积为纵坐标，计算各个单糖标准品的曲线方程，结果如表1所示。

表1 单糖标品曲线方程

由表1可知，各单糖标品峰面积与单糖浓度之间均呈良好的线性关系，且相关系数均在99%以上。

2.2.2 精密度实验

将各个单糖标准品溶液分装于5个样品瓶中，经衍生化处理后，HPLC色谱测定5次，计算峰面积，根据公式(3)、(4)、(5)(6)计算得出RSD值，结果如表2所示。

表2 单糖标品精密度实验表

由表2可知，各单糖经5次测定峰面积计算出各单糖标品的RSD值分别为：Glc0.45%；Gal 0.86%；Flu 0.70%；Man1.19%；Rha0.76%；Ara0.84%，表明此HPLC条件精密度良好，设计合理，较为适宜于测定覆盆子多糖中各单糖含量。

2.2.3 重复性试验

分别提取覆盆子多糖样品5份，经水解衍生处理后，高效液相色谱测定样品中各个单糖含量，测定后分别计算各单糖的RSD值，结果如表3所示。

表3 覆盆子多糖各单糖组成重复性实验

由表3可知，经水解衍生后，覆盆子各单糖成分经5次HPLC测定，结果各单糖的RSD值分别为Glc0.95%；Gal 0.79%；Flu 0.55%；Man0.79%；Rha0.19%；Ara0.68%，表明该HPLC试验条件重复性良好。

2.2.4 稳定性实验

取经处理好的覆盆子多糖溶液一份，分别在0、4、8、12、16 h时分别进样测定分析，结果如表4所示。

表4 覆盆子多糖各单糖组成稳定性实验

如表4可知，经处理后的覆盆子多糖在不同时间点测定各单糖含量，并计算RSD值，分别为Glc0.76%；Gal 0.27%；Flu 0.91%；Man0.73%；Rha0.30%；Ara0.11%，表明该HPLC法测定覆盆子多糖中的各单糖含量在16 h稳定。

2.2.5 回收率实验

表5 覆盆子单糖回收率实验

取覆盆子多糖液一份，经处理后，测定覆盆子多糖中的各单糖物质含量，分别加入一定浓度各单糖标品，经衍生处理后，测定加标后各单糖含量，计算回收率，结果如表5所示。

由图5可知，经加标后，各单糖标品的回收率在96.16%～102.67%之间，表明标品回收良好，此方法适宜于覆盆子多糖中各单糖含量的测定。

2.3 覆盆子多糖衍生物分析

取一定量覆盆子多糖样品，经水解衍生处理后，HPLC法测定各单糖组成及含量，结果如图2及表6所示。

3 结论

经分离后的覆盆子粗多糖采用柱前水解衍生处理，利用HPLC法对覆盆子多糖中的单糖组成及含量进行测定，结果表明，HPLC条件分离分析覆盆子多糖中单糖含量及组成实验精密度良好，实验条件重复性良好且较稳定，覆盆子多糖中含有葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等六种单糖，且其物质的量比例为0.05∶1.37∶0.20∶0.10∶1.00∶1.95。