美藤果壳提取物降血压功效的研究

蔡欣，马晓伟，黎攀，杨运云，杜冰，*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州510663；3.广东省测试分析研究所，广东广州510070）

高血压是一种在我国患病率较高、致残率较高的慢性疾病[1]，长期发展可造成脑、心脏、肾脏等靶器官的严重损害[2]。血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一种哺乳动物组织中普遍存在的、含Zn2+的二肽羧肽酶[3]。一方面ACE 可作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的血管紧张素I，使之转化为有效的血管收缩剂——血管紧张素II[4]。另一方面ACE 也可使激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）中具有舒张血管紧张作用的激肽失活，KKS 系统处于抑制状态，间接导致压力升高[5]。

研究表明，抑制ACE 的活性，可以有效防止血压升高[6-7]。合成的血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensinconverting enzyme inhibitor，ACEI）（卡托普利、赖诺普利等）已广泛用作抗高血压药物，但由于这类合成药物在长期使用过程中常伴有一系列不良反应，如咳嗽、水肿、皮疹和肾功能损伤等[8-9]。从天然动植物中提取的ACE 抑制剂，由于其副作用低、安全性高等优点，而更受关注。

体外检测ACE 抑制率作为评价ACE 活性的一类方法[10]，可方便有效地筛选具有ACE 抑制的组分。三肽Hip-His-Leu（HHL）在ACE 的催化下快速地分解产生马尿酸和二肽His-Leu（HL），马尿酸在228 nm 处有特征紫外吸收峰[11]。本研究通过高效液相色谱（high efficiency liquid chromatography，HPLC）测定反应体系中马尿酸的含量，确定ACE 的抑制率[12-13]，进而筛选具有ACE 抑制活性的组分。

美藤果（Plukenetia volubilis L.）又名印加果、南美油藤、星油藤，为大戟科多年生木质藤本植物植物[14]，原产于南美亚马逊地区的热带雨林，后经引进在我国云南省成功种植[15]。目前，对其研究主要集中在美藤果油和美藤果蛋白[16-18]，而有关美藤果果壳的研究一直处于空白状态。本文以云南普洱地区种植的美藤果的果壳为原料，通过HPLC 测定反应体系中马尿酸含量的方法测定ACE 的抑制率，结合自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）模型，侧重评价美藤果壳提取物的降血压功效，并对其安全性及有效降压部位进行初步评价。

1 材料

1.1 原料

美藤果壳：普洱市联众生物资源开发有限公司。

1.2 试验试剂

血管紧张素转化酶、马尿酸、HHL、卡托普利：美国Sigma 公司；银杏提取物（含22%银杏黄酮）、菊花提取物（含3%菊花黄酮）：齐云生物技术有限公司；硅胶（200 目～300 目）：上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈、三氟乙酸（色谱纯）：Hollywell 公司；硼酸、氯化钠、氢氧化钠等分析纯：广州化学试剂厂；盐酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 试验仪器

UltiMateTM3000 高效液相色谱：赛默飞公司；DFT-200C 万能粉碎机：上海机械有限公司；Centrifuge 5804/5804 R 台式多功能离心机：德国Eppendorf；ModulyoD真空冷冻干燥机：美国Thermo 公司；BP-2010A 无创血压仪：北京软隆生物技术有限公司；FA2004 电子分析天平：上海科学仪器厂；RE-52A 旋转蒸发器：上海亚荣仪器有限公司；DLSB-低温冷却液循环泵、R210D恒温水浴锅：上海豫康有限公司。

1.4 实验动物

SPF 级昆明小鼠 60 只，SHR 大鼠（雌雄各 3 只），WKY 大鼠（高血压大鼠对照模型，雌雄各15 只）。

2 方法

2.1 ACE-HHL-ACEI反应体系

配制 0.10 mol/L 的硼酸缓冲液（pH 值=8.3）、1.00 mmol/L 马尿酸溶液、5.00 mmol/L 的 HHL 溶液和1.00 mol/L 的盐酸溶液待用。0.25 U 的ACE 溶解在2.5 mL 的硼酸缓冲液中。

按表1 进行反应，反应结束后以10 000 g 离心10 min，取 400 μL 上清液，用 0.45 μm 的微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱测定生成马尿酸（Hip）的含量，计算ACE 的抑制率。

表1 ACE 抑制剂活性检验的加样步骤Table 1 Steps to add samples in ACE inhibitory activity assay

高效液相色谱条件[19]：安捷伦SB-C18 色谱柱（5μm×4.6 mm×250 mm），柱温 25 ℃，流速 1 mL/min，流动相为乙腈-超纯水（体积比25 ∶75，各含0.1%的三氟乙酸），检测波长 228 nm，进样量 10 μL。

式中：S 为空白对照组中马尿酸的峰面积；S1 为样品组中马尿酸的峰面积。

2.2 美藤果壳降压提取物（sacha inchi shell water extract，SISE）制备

2.2.1 原料预处理

取美藤果壳投入汽爆罐，加水浸泡使其含水量约为 50%，在170 ℃、1.0 MPa 下保压30 s，汽爆处理结束后收集物料。此工艺条件下物料粉碎度适宜，遇水不易结块，符合下一步提取要求。

2.2.2 提取溶剂筛选

精确称取美藤果壳粉末（过40 目筛）1.0 g 置于碘量瓶中，分别选用水、乙醚、石油醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂。置于60 ℃水浴中振荡提取2 h，超声处理30 min 后静置、离心，取2 mL上清液，挥干后用1 mL 含2%吐温80 的溶液中，制成浓度为0.1 g/mL 的样品液。测定各样品组的ACE 抑制率，测定方法参照2.1。

2.2.3 降压有效壳层筛选

制备美藤果壳、美藤果外壳、美藤果壳内壳和美藤果内皮的提取物冻干粉，提取物统一配制成40 mg/mL的样品液，测定各样品组的ACE 抑制率，测定方法参照2.1。

2.2.4 美藤果壳提取物制备方法

确定有效壳层和提取溶剂后，采用热浸提法，将原料汽爆处理后，按照料液比1 ∶40（g/mL）加入提取溶剂，提取温度105 ℃，提取时间3 h。提取结束后，将提取液低温浓缩至1/4 体积后，冷冻干燥制得冻干粉，即为美藤果壳提取物，简称为SISE，用于研究。

2.3 美藤果壳提取物毒理学评价

采用国家标准GB 15193.3-2014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》中的限量法。选取SPF 级昆明小鼠60 只，随机分为实验组和空白对照组。实验组灌胃提取物，剂量为12.0 g/Kg·BW，空白组以生理盐水作对照。灌胃结束后，观察期限为7 d，观察并记录小鼠状态（外观、行为活动、排泄和死亡情况），测量记录小鼠体重变化。观察期结束后，小鼠称重、处死、解剖，病理检查主要脏器（心、肝、脾、肾）并计算脏器指数[20]。

2.4 美藤果壳降压提取物与其他ACEI效果对比

制备美藤果壳提取物，另取银杏提取物、菊花提取物和药品卡托普利作为阳性对照组，提取物统一配制成40 mg/mL 的样品液，卡托普利配制成0.5 μg/mL的样品液，测定各样品组的ACE 抑制率，测定方法参照2.1。

2.5 美藤果壳提取物体内短期降血压效果评价

将SHR 大鼠分为5 组：阳性对照组、阴性对照组、低、中、高剂量组，每组雌雄大鼠各 3 只；WKY 大鼠，雌雄各3 只作为正常对照组。阳性对照组：卡托普利5 mg/kg·BW；阴性对照组：灌胃蒸馏水；低剂量组：美藤果壳提取物50 mg/kg·BW；中剂量组：美藤果壳提取物100 mg/kg·BW；高剂量组：美藤果壳提取物400 mg/kg·BW；正常对照组：灌胃蒸馏水。

按受试剂量对各组大鼠给药，以灌胃后0、0.25、0.5、1、2、4、6 h 为测定时间点，分别测定各组在各血压监测时间点对应的血压值，测定时每只大鼠测定3 次并取平均值[21]。

2.6 美藤果壳降血压有效成分筛选

采用2.2.4 方法制备美藤果壳提取物浓缩液。依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别收集各有机相萃取层，保留最终剩余的水层。各萃取层挥干后分别制成浓度为0.10 g/mL 的样品液。测定各样品组的ACE 抑制率，测定方法参照2.1。

取上述方法中活性最高的萃取物0.5 g，以90%甲醇溶解后经硅胶柱，氯仿/甲醇梯度洗脱，设置100 ∶0、9 ∶1、7 ∶3、5 ∶5、3 ∶7、1 ∶9、0 ∶100 7 个梯度，每个梯度3 个柱体积，柱体积为100 mL。参照2.1 方法测定7 个馏分的ACE 抑制率。

3 结果与分析

3.1 ACE-HHI-ACEI体系的建立

马尿酸标准曲线的高效液相色谱图见图1。

图1 马尿酸标准曲线的高效液相色谱图Fig.1 Chromatogram of the standard solution of hippuric acid

在本试验色谱条件，能有效分离浓度为0.005 mmol/L～0.5 mmol/L 的马尿酸标准溶液，马尿酸的出峰时间为4.147 min。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性方程为y=1 714.3x+1.113 8，R2=0.999 7，马尿酸标准曲线线性关系良好。

3.2 美藤果壳提取溶剂和有效壳层的筛选

3.2.1 提取溶剂筛选

不同溶剂美藤果壳提取物的ACE 抑制率见图2。

图2 不同溶剂美藤果壳提取物的ACE 抑制率Fig.2 ACE inhibition rate of extracts by different extraction solvent

如图2 所示，选择极性不同的提取溶剂对美藤果壳进行提取，结果发现，水提取物效果最好，而甲醇、乙醇提取物的效果也优于其他有机试剂，这可能由于美藤果壳中的降压有效成分含有一定的亲水基团（如羟基），使其在水、醇类溶剂中溶出率更高。因此，最终选定水作为提取美藤果壳降血压物质的溶剂，其提取物简称为SISE。

3.2.2 美藤果壳有效壳层筛选

不同美藤果壳层提取物的ACE 抑制率见图3。

图3 不同美藤果壳层提取物的ACE 抑制率Fig.3 ACE inhibition rate of extracts from different shell parts

通过比较美藤果壳各壳层的提取物的ACE 抑制活性，发现美藤果果壳提取物的ACE 抑制率显著优于其他单一壳层，这可能是因为在提取过程中果壳的内外两层中的物质会发生反应，从而表现出协同作用[22]；外壳提取物的ACE 抑制率优于内壳，这可能是因为外壳提取液中物质更为丰富，而内壳主要是木质纤维，有效成分少。因此选定美藤果壳作为提取研究的对象。

3.3 提取物降压活性评价

3.3.1 SISE 对ACE 的抑制效果评价

SISE 与其他ACEI 的ACE 抑制率见图4。

图4 SISE 与其他ACEI 的ACE 抑制率Fig.4 ACE inhibition rate of SISE and other ACEI

如图4 所示，在同等浓度下，SISE 的ACE 抑制率显著（P＜0.05）高于其他天然的ACEI。而且SISE（40 mg/mL）的抑制效果也要优于卡托普利（0.5 mg/mL）。美藤果壳提取物在抑制ACE 活性方面具有优势，纯化分离其有效降压成分具有深远意义。

3.3.2 SISE 短期降血压功效评价

SISE 短期降血压效果见图5。

图5 SISE 短期降血压效果Fig.5 Short-term anti-hypertensive effect of SISE

如图5 所示，SHR 大鼠经低剂量（50 mg/kg·BW）和中剂量（100 mg/kg·BW）的给药后其收缩压未显著降低，而经高剂量（400 mg/kg·BW）的 SISE 给药 0.5 h后收缩压显著降低，给药1 h 后SHR 大鼠收缩压由166 mmHg 显著降低至135 mmHg，说明SISE 具有降血压的功效。与阳性对照组相比，高剂量（400 mg/kg·BW）的SISE 短期内降压维持时间（用药后0.5 h 至4h）比400 mg/kg·BW 的卡托普利（用药后 0.5 h 至 1 h）长。

3.4 美藤果壳提取物毒理学评价

3.4.1 SISE 小鼠急性毒理学实验

美藤果壳属于新物质，须对其进行安全性评价。以最大给药量12 g/kg 灌胃小鼠，观察期内，小鼠饮食、活动均未受影响，排泄正常，身体各处未见异常分泌物或其他不良反应。观察期结束后7 d 内未出现死亡或其他临床异常表现。

3.4.2 SISE 对小鼠体重和脏器的影响

在观察期内，实验组和空白组小鼠体重逐渐增加，且体重变化水平未见明显差异见图6 A 和图6B，说明灌胃SISE 未影响小鼠体重增长。解剖后观察小鼠主要脏器，未见明显损伤或病变，计算其脏器指数亦未见明显差异见图6 C。依据国家标准的毒物分级判断SISE 为食品级无毒。

图6 各组小鼠观察期内体重变化及主要脏器指数Fig.6 Changes of weight in mice during observation period and organ index

3.5 美藤果壳降血压成分有效部位的分离纯化

3.5.1 萃取分离

不同萃取层的ACE 抑制率见图7。

本研究进一步筛选了SISE 依次经不同极性的有机溶剂萃取后，ACE 抑制率最高的萃取部位。图7 表明，正丁醇萃取物具有最佳的ACE 抑制作用，ACE 抑制率达到53.83%，显著高于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂萃取物的抑制率，因此选取正丁醇萃取物进行进一步的分离纯化。

图7 不同萃取层的ACE 抑制率Fig.7 ACE inhibition rate of extracts by different extraction solvent

3.5.2 硅胶柱层析

本研究还进一步筛选了正丁醇萃取物中降血压成分的有效部位，不同洗脱组分的ACE 抑制率见图8。

图8 不同洗脱组分的ACE 抑制率Fig.8 ACE inhibition rate of extracts from different elution component

如图8，采用氯仿/甲醇（7 ∶3）洗脱得的组分 ACE抑制效果最佳，ACE 抑制率达到97.77%，这对后续分离纯化单体提供了方向。

4 结论

本研究以ACE-HHL-ACEI 反应体系为体外模型，筛选最佳提取溶剂和壳层，并结合SHR 大鼠模型，初步评价了美藤果壳提取物的降血压功效体外实验表明，美藤果壳提取物对ACE 活性抑制率为74.18%，显著高于其他天然ACEI（菊花、银杏提取物）。动物实验表明，高剂量（400 mg/kg·BW）的 SISE 显著降低了SHR 大鼠的血压水平，用药1 h 后SHR 大鼠收缩压由166 mmHg 降低至135 mmHg。体内外实验结果初步证实了SISE 具备降血压功效。急性经口毒性试验表明SISE 属于食品级无毒，且在观察期内对实验组小鼠体重、脏器功能无不良影响。

本研究还对SISE 有效降压成分进行初步分离，体外实验表明其有效降压成分主要集中在正丁醇萃取物中，其ACE 抑制率为53.83%；正丁醇萃取物经硅胶柱，氯仿/甲醇梯度洗脱，氯仿/甲醇（7 ∶3）组分的 ACE抑制效果最佳。本研究初步证实了美藤果壳水提取物的降压功效，且发现有效降压成分主要集中在正丁醇萃取物中，为进一步研究和开发美藤果壳作为天然降血压药物奠定了基础。