化痰活血益气方对异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚大鼠神经内分泌因子以及Akt信号磷酸化的影响*

★ 常欣峰 宋春花 龙笑影 韩立民**（.赣南医学院 江西 赣州 34000；.赣南医学院第一附属医院 江西 赣州 34000）

心肌肥厚以心肌细胞肥大及心肌间质异常为基本病理改变，是心脏对血流压力负荷增加的主要代偿机制，主要见于高血压[1]与血管疾病[2]。心肌病理性重构是心力衰竭的主要发病机制之一，神经内分泌系统的过度激活是心肌病理性重构、心衰的发生发展的重要因素[3]。本研究采用异丙肾上腺素（Isoproterenol，Iso）诱导的大鼠心肌肥厚模型，拟观察化痰活血益气复方的抗心肌肥厚作用及对神经内分泌因子血管紧张素（angiotensinⅡ，AngⅡ）、醛固酮（aldosterone，ALD）、内皮素-1（endothelin-1，ET-1）及Akt信号磷酸化水平的影响。

1 实验材料

1.1 动物 雄性SD大鼠，SPF级，体重200～250g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2013—0004，饲养于赣南医学院实验动物中心。

1.2 药物 化痰活血益气方（法半夏10g、陈皮10g、葶苈子15g、酒丹参20g、生黄芪20g、茯苓15g、炙甘草3g）由赣南医学院科研中心提供，经称重、浸泡、煎煮3次，浓缩至0.9765g/mL（含生药）。葶苈子、陈皮、茯苓购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，半夏、甘草购自江西樟树庆仁中药饮片有限公司，丹参购自江西樟树彭氏国药堂饮片有限公司，黄芪购自安徽普仁中药饮片有限公司。卡托普利片购自江苏天士力帝益药业有限公司。

1.3 试剂 Iso（货号：I5627-5G）购自美国Sigma-Aldrich公司，AngⅡ（货号：CEA005Ra）、ALD（货号：CEA911Ge）、ET-1（货号：CEA482Ra）ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，p-Akt（货号：9271S）、Akt（货号：9272S）及β-Tubulin（货号：2128S）抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（货号：ZB-2301）抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 动物模型建立、分组及给药 48只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、复方低剂量组、复方中剂量组、复方高剂量组和卡托普利组，每组8只。各组（除正常组）大鼠背部皮下注射Iso 1mg/kg，每日1次，连续10d；正常组大鼠背部皮下注射等剂量的生理盐水。自由进食，饮水。于造模次日，各治疗组开始灌胃给药，每日两次，每次间隔8h以上，连续14d。复方低、中、高剂量组和卡托普利组分别灌胃以化痰活血益气方4.88，9.77，19.53mg/kg/d和卡托普利0.02mg/kg/d。给药量按照《药理实验方法学》[6]所示体表面积剂量换算法计算，复方低、中、高剂量和卡托普利分别给予成年人0.5倍、1倍、2倍和1倍的等效剂量，正常组、模型组灌胃以相同体积的生理盐水。

2.2 心脏指数测定 末次给药后禁食、不禁水12h，称重，10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g，i.p.），腹主动脉采血后取心脏，生理盐水洗净，冰上去除心房组织、分离左右心室，滤纸吸干后，称量左心室重、全心重。计算左心室重量指数（left ventricle mass index，LVMI） = 左心室重量（mg）/体重（g），全心重量指数（heart mass index，HMI） = 全心重量（mg）/体重（g）。

2.3 ELISA法检测血清AngⅡ、ALD、ET-1含量 腹主动脉采血，置于4℃冰箱中保存，待凝血坚实、血清析出后，4℃ 3500 r/min离心10min，分离血清。按照ELISA试剂盒说明书操作，依次检测血清AngⅡ、ALD、ET-1的含量。

2.4 Western blot法检测心肌组织Akt蛋白水平及其活性形式p-Akt蛋白水平的表达 取50μg心肌组织蛋白样本，经电泳、湿法转膜后，分别孵以一抗p-Akt（1∶200）、Akt（1∶400）及β-Tubulin（1∶1000），4℃转移摇床过夜。TBST清洗后，孵以对应二抗（1∶1000），室温水平摇床摇晃1h后，行化学发光。用Image Lab 5.1软件测量蛋白条带面积并进行灰度分析，计算p-Akt/Akt比率。β-Tubulin作为内参使用。

2.5 统计学方法 用SPSS 20.0软件进行数据统计。所有数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 化痰活血益气方对心脏指数的影响 与正常组相比，模型组的LVMI与HMI均明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，复方中剂量组的LVMI与HMI均明显降低（P＜0.05），卡托普利组的LVMI明显降低（P＜0.05）。结果见表1。

表1 化痰活血益气方对心脏指数的影响（）

表1 化痰活血益气方对心脏指数的影响（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 n 剂量/mg·kg-1·d-1 LVMI/mg·g-1 HMI/mg·g-1正常组 8 — 2.06±0.09 2.64±0.11模型组 4 — 2.64±0.09* 3.37±0.16*复方低剂量组 5 4.88 2.50±0.11 3.25±0.12复方中剂量组 5 9.77 2.45±0.11# 3.09±0.18#复方高剂量组 6 19.53 2.54±0.10 3.29±0.14卡托普利组 5 0.02 2.47±0.09# 3.24±0.14

异丙肾上腺素可以兴奋心肌β1肾上腺素受体，增快心率、增强心肌收缩力，增加心脏传导系统的传导速度，缩短窦房结的不应期，升高血压以增加心脏压力负荷，为心肌肥厚的常用造模药物。经查阅，中文文章所用异丙肾上腺素多为国产，动物死亡率相对较低。本实验所用异丙肾上腺素购自美国Sigma公司且为近期生产，药效好且质量有保证。在本实验中，给大鼠皮下注射异丙肾上腺素后大鼠出现了心跳加快、心脏骤停乃至猝死等现象，大鼠死亡乃造模药物药效反应、机体不能代偿所致。正常组、模型组及给药组大鼠死亡数目不一，正常组无死亡，模型组死亡最多，治疗组死亡较少，可能与治疗药物干预有关。

3.2 化痰活血益气方对神经体液因子的影响 与正常组相比，模型组的血清AngⅡ、ALD、ET-1水平明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，复方低、中剂量组和卡托普利组的血清AngⅡ水平，复方中剂量组的血清ALD水平以及复方中剂量组和卡托普利组的血清ET-1水平均明显降低（P＜0.05）；在各治疗组中，复方中剂量组的血清AngⅡ、ALD、ET-1水平均为最低。结果见表2。

表2 化痰活血益气方对神经体液因子的影响（）

表2 化痰活血益气方对神经体液因子的影响（）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 n 剂量/mg·kg-1·d-1 AngⅡ/pg·mL-1 ALD /pg·mL-1 ET-1 /pg·mL-1正常组 8 — 160.86±85.11 38.40±22.98 89.54±12.34模型组 4 — 422.53±83.31** 95.55±26.05** 142.03±11.35**复方低剂量组 5 4.88 267.85±104.47# 59.08±28.80 129.04±11.02复方中剂量组 5 9.77 247.17±74.19# 48.95±18.81# 113.43±15.32#复方高剂量组 6 19.53 327.57±79.12 79.93±23.56 137.79±13.15卡托普利组 5 0.02 261.83±51.60# 54.25±22.24 119.32±11.50#

3.3 化痰活血益气方对p-Akt、Akt蛋白表达水平及p-Akt/Akt比率的影响

3.3.1 化痰活血益气方对p-Akt、Akt蛋白表达的影响 如图2所示，各组p-Akt蛋白的表达水平存在显著性差异。与正常组比较，模型组的p-Akt条带面积明显增大；与模型组比较，复方低、中、高剂量组的p-Akt条带面积有不同程度的减小，卡托普利组的p-Akt条带面积无明显增减。在各治疗组中，复方中剂量组的p-Akt条带面积最小。各组Akt、β-Tubulin蛋白的表达水平未见显著性差异。

图2 化痰活血益气方对p-Akt、Akt、β-Tubulin蛋白表达的影响

3.3.2 化痰活血益气方对p-Akt/Akt比率的影响 本实验每组取4只大鼠，每只大鼠重复2次。与正常组比较，模型组的p-Akt/Akt比率明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，复方低剂量组和中剂量组的p-Akt/Akt比率均明显降低（P＜0.05），复方高剂量组的p-Akt/Akt比率虽有降低但差异无统计学意义性（P＞0.05），卡托普利组的p-Akt/Akt比率无明显增减（P＞0.05）。在各治疗组中，复方中剂量组的p-Akt/Akt比率最低。结果见表3。

表3 化痰活血益气方对p-Akt/Akt比率的影响（，n=8）

表3 化痰活血益气方对p-Akt/Akt比率的影响（，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 剂量/mg·kg-1·d-1 p-Akt/Akt比率正常组 — 1模型组 — 1.98±0.68*复方低剂量组 4.88 0.79±0.32#复方中剂量组 9.77 0.68±0.57#复方高剂量组 19.53 1.52±0.58卡托普利组 0.02 1.98±0.44

4 讨论

心肌肥厚是血流压力负荷增加时的一种适应性反应[4]，然而长期持续的血流压力超负荷会使心脏失代偿，最终导致心力衰竭的发生[5]。尽管给予西药干预，由心肌肥厚所导致的心衰的发病率和病死率仍然居高不下[6]。中医药是一个伟大的宝库，抗心肌肥厚的现代中医药研究主要是以其中医病机为依据，在相应治法的指导下，针对单味中草药及其中药单体和中药复方展开的。近年来，国内外学者在研究单味中草药及其中药单体治疗心肌肥厚方面取得了显著进展，但基于中医病机的中药复方研究却鲜有闻及。这不仅不利于本病中医认识的发展，而且在一定程度上阻碍了中药多组合、多靶点优势的发挥，影响了本病的中医临床治疗。本研究以“痰瘀互结、正气亏虚” 为心肌肥厚的中医病机理论，以二陈汤为化痰的基础方，配以化痰之葶苈子、活血之丹参、补气之黄芪，组建了化痰活血益气方；该方以半夏、葶苈子化痰，为君药；丹参活血、黄芪补气、陈皮理气化痰，三者共为臣药；佐以茯苓健脾利湿；炙甘草调和诸药以为使。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活是心肌肥厚发生的重要病理机制。肾小球入球小动脉的球旁细胞分泌肾素，激活肝脏产生的血管紧张素原进而生成血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ经血管紧张素转换酶作用生成AngⅡ。AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应物质，具有收缩血管、升高血压、促进ALD分泌和钠水潴留、增强交感神经活性、促进细胞生长和血管生成等作用[7]。研究发现，AngⅡ参与了心肌肥厚的形成[8]。ALD可以激活交感神经系统[9]，并促进成纤维细胞增殖[10]进而导致心肌间质胶原合成增加，促进心室重构。此外，ALD还可以增加组织对AngⅡ的结合并增强AngⅡ的生物学效应[11]。内皮素（endothelin，ET）是一种具有强大收缩血管作用的活性多肽，是调控心血管功能的重要因子，也是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的刺激物[12]。ET包括ET-1、ET-2、ET-3和血管活性肠收缩肽4种亚型，其中又以ET-1活性最强。研究发现，ET-1可以通过激活MAPK和CaMKⅡ信号通路增加心肌的收缩性，并促进心肌细胞肥大进而导致心肌肥厚的形成[13]。

Akt信号的异常调节在肿瘤、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病的发病中均起着重要作用[14]，也是现今细胞分子机制研究的一大热门。PI3K/Akt信号通路是病理性心肌肥厚的一条重要信号转导通路[15]。PI3K使细胞膜4，5二磷酸磷脂酰肌醇磷酸化，并与Akt及其激活剂3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1结合，生成3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇，进而导致Akt的磷酸化与激活[16]，活化的Akt激活相关基因的表达最终引发心肌肥厚。p-Akt/Akt比率是磷酸化的Akt与总的Akt的灰度比值，反应的是Akt的活化程度，即总的Akt中有多少比例发生磷酸化（即活化）。

本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠的LVMI、HMI、AngⅡ、ALD、ET-1和p-Akt/Akt均明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明Iso诱导的心肌肥厚造模成功，模型组已形成心肌肥厚。与模型组相比，复方低、中、高剂量组与卡托普利组的LVMI、HMI、AngⅡ、ALD、ET-1和p-Akt/Akt均有不同程度的降低，复方中剂量组的上述各项指标始终存在显著性差异（P＜0.05）。这表明：①化痰活血益气方可以有效改善Iso诱导的心肌肥厚并降低神经内分泌因子AngⅡ、ALD、ET-1含量；②在各剂量组中，等效于成人剂量的中剂量组疗效最好，且该组疗效优于卡托普利组；③该复方可能通过抑制Akt信号的磷酸化来发挥其抗心肌肥厚作用。本研究以 “痰瘀互结、正气亏虚” 为心肌肥厚的中医基本病机，采用化痰活血益气方对Iso诱导的大鼠心肌肥厚模型进行干预，以明确其抗心肌肥厚作用及对神经内分泌因子AngⅡ、ALD、ET-1及Akt信号磷酸化水平的影响，以求为心肌肥厚“痰瘀互结，正气亏虚”的中医病机提供了细胞生物学支持，为心肌肥厚“化痰、活血、益气”的中医治法提供了实验依据，为广大临床医者组方治疗心肌肥厚时起到抛砖引玉、投石问路之效。