复方丹参滴丸改善心肌缺血再灌注损伤研究进展

梁茜 李炜杰 杨希立 王蔚 田平阁

心肌缺血是心肌细胞氧供需失衡的结果。尽早进行血运重建是减少心肌缺血后损伤最有效的方法,但是会伴随出现心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/R 损伤)。I/R 损伤通过钙超载、细胞凋亡、线粒体损伤、氧自由基生成增加、自噬等机制发挥作用［1］。其中,越多越多的研究表明自噬在I/R 损伤和恢复中起着重要的作用。复方丹参滴丸为现代中药制剂,具有理气止痛、活血化瘀功效。近年来关于丹参滴丸抗I/R 损伤的研究逐渐增多,是首个通过美国食品药品管理局(FDA)Ⅲ期临床试验的中成药。其作用机制也日益受到国内外研究人员的关注。本文主要通过回顾I/R 损伤的机制以及复方丹参滴丸在冠心病尤其是I/R损伤治疗中的分子机制调节作用做文献综述。

1 I/R 损伤影响以及机制

1.1 I/R 损伤的影响 I/R 损伤主要体现为以下4 种临床表现。①再灌注性心律失常,多发生在再灌注开始时,常出现加速性室性自主心律、实行心动过速、室颤等现象,但多为一过性的。②心肌顿抑,心肌恢复灌注后处于可逆性心肌收缩功能失调,持续数小时、数天甚至数周。③血液无复流,缺血心肌在冠脉闭塞或狭窄解除后仍未能恢复有效再灌注,微循环血流仍未完全恢复正常的现象。Eeckhout 等［2］根据无复流的特征将其分为3 类：①实验性无复流；②心肌梗死再灌注无复流；③血管造影无复流：常规经皮冠状动脉介入(percutaneouscoronary intervention,PCI)过程中产生的无复流;④微循环障碍,I/R 会引发内皮细胞功能失调进、破坏血管内皮结构进而阻碍了微血管内血液循环。同时,I/R 极易引起微动脉粥样斑块破裂、形成微血栓,进一步加重心肌缺血［3］。

1.2 I/R 损伤的机制 I/R 的发生机制主要有以下几点。

1.2.1 产生过多的氧自由基(OFR) OFR 是机体内氧分子还原的中间产物。生理状态下,OFR 可被过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)多种酶清除,减少其对细胞的损伤。当心肌发生I/R 时,OFR 氧化心肌细胞膜中的不饱和脂肪酸,生成脂质过氧化物(LPO)。生物膜脂质过氧化后,可引起细胞膜功能和结构的障碍、膜磷脂成分改变、通透性增加,最终造成心肌细胞功能和结构的损伤。

1.2.2 钙超载 在心肌缺血缺氧的过程中,细胞内的糖酵解逐渐增强,引起乳酸堆积,最后导致心肌细胞酸中毒。恢复心肌血运重建后,乳酸等代谢产物随血液流走,细胞外pH 值升高,使细胞膜上Na-H 离子交换增加,而Na+浓度升高激活Na-Ca 离子交换,使心肌细胞钙离子超载,引起细胞膜结构的损伤［3］。在心肌I/R 过程中,钙超载和OFR 过度生成相互促进,形成恶性循环,加重心肌损伤。同时引起心肌细胞膜电位异常,诱发恶性心律失常等。

1.2.3 心肌细胞凋亡 I/R 后,由于细胞内OFR 增多和Ca2+超载,细胞核内凋亡基因Bcl-2/bax、抑癌基因P53、Bcl-xL、Fas/Fas-L、肿瘤坏死因子高表达,心肌细胞会启动凋亡程序。刘艳霞等［4］通过建立心肌缺血再灌注大鼠模型,应用缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡情况,结果显示,缺血再灌注组的细胞凋亡率显著升高,同时凋亡调控基因Bcl-2、Bax 蛋白表达量显著升高,这表明细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤的过程中起到了关键作用。

1.2.4 细胞自噬 多年来,人们对致死性的I/R 损伤的治疗着力于如何减轻损伤所引起的细胞坏死和Ⅰ型程序性细胞死亡上。然而随着对自噬(Ⅱ型程序性细胞死亡)研究的深入,人们发现这一细胞内能量、物质的自我代谢过程在对抗心肌缺血再灌注损伤及梗死后心脏重构和恢复上起着重要作用,为人们治疗缺血再灌注损伤提供了新的治疗靶点。自噬的过程大致可分为4 个阶段。第一阶段：在饥饿等应激状体下,Ⅲ型磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)被激活,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)受到抑制,诱导自噬发生。第二阶段：PI3K 和Beclin1 等自噬相关基因(Atg)蛋白结合组装,并不断延长,包裹降解物质形成自噬体。此时电镜下可观察到独特的双层膜结构小体,因此通过检测和评估小体的数量可作为评估自噬活性的金标准［5］,而Beclin 1 成为自噬增加的重要标志之一［6,7］。另一方面Atg8,也称为微管相关蛋白轻链3 (microtubuleassociated protein light chain 3,LC3),被水解激活成胞质可溶性的LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ,其与其他Atg 蛋白锚定在自噬体膜上,是促进自噬体延长及成熟的关键元素。因此通过荧光标记细胞内LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的含量可以看作是自噬发生的依据［8］。第三阶段：自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体。第四阶段：自噬溶酶体内的物质被降解并被机体再利用。P62 同样是自噬过程中重要的标记蛋白。它作为连接LC3 和泛素化物质的纽带,并入成熟的自噬体中,并被自噬溶酶体降解。它能很好的反映细胞内被降解物的清除程度。P62 含量的升高意味着细胞内降解物的清除不足,自噬过程受到抑制,有研究发现其与自噬程度有良好的负相关性［9,10］。Matsui 等［11］结扎大鼠冠状动脉20 min 后发现,在缺血心肌部分用免疫荧光标测LC3-Ⅱ,其含量明显大于非缺血心肌部分。在其他离体心肌细胞及动物模型实验上,通过电镜及免疫标测LC3-Ⅱ同样也观察到自噬的上调［12］。虽然有部分学者提出了不同的声音,认为自噬的上调对心肌的作用依赖于缺血的程度、持续时间,甚至还与受损的细胞类型及缺血部位密切相关。在一些实验中,研究者发现自噬的过度表达不利于心肌细胞的存活、细胞凋亡的抑制以及梗死面积的控制［13］。

2 复方丹参滴丸概况

复方丹参滴丸是一种采用现代药学制剂技术研制的纯中药滴丸剂,主要含有丹参素、丹参酮ⅡA、三七、皂苷等有效成分。丹参,味苦微寒,有凉血消肿、养血安神的功效。三七,味苦甘,性温,有止血止痛、活血化瘀作用。冰片为化学合成物,可引导其他药物进入靶点以发挥药效,具有开窍醒神、清热止痛的作用［14］。研究表明,复方丹参滴丸中以丹参素为主的水溶性成分具有抗血小板聚集,扩张冠状动脉,保护心肌缺血作用。而以丹参酮ⅡA 为主的脂溶性成分可明显减少心肌梗死面积,刺激血管内皮细胞产生NO 并且能抑制血管紧张素Ⅱ引起的内皮细胞增生［15］。皂苷类成分具有改善血流动力学,保护内皮细胞,抗血栓形成等功能［16］。在已完成的美国FDA Ⅲ期实验中,复方丹参滴丸能显著提高最大运动耐受时间和减少心绞痛发作次数(T89-07-CAESA,http://clinicaltrials.gov/)。

3 复方丹参滴丸用于I/R 损伤治疗的分子机制

3.1 抗氧化作用 赵倩等［17］通过构建心肌缺血再灌注 SD 大鼠模型,再灌注结束后检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活力,并采用“伊文氏蓝-TTC”法测量计算心肌梗死面积,发现复方丹参滴丸和缺血后处理均可以减少心肌梗死面积,减少血清CK、LDH 的释放(P＜0.05)。心肌缺血时会发生有氧代谢障碍,细胞内乳酸堆积,细胞内酸中毒,使心肌出现兴奋-收缩耦联障碍,心肌收缩力减弱、心室功能降低［18］。徐曼等［19］在细胞水平的研究中发现,复方丹参滴丸可以下调 Fas 基因及其配 体 FasL 蛋白表达,减少凋亡,从而减轻缺氧造成的损伤。核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是重要的抗氧化蛋白,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)信号通路是近年来发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路［20］。而研究表明复方丹参滴丸可激活 PI3K/AKT 通路诱导AKT 磷酸化,上调Nrf2 表达,从而启动内源性抗氧化反应,抑制氧化应激损伤。

3.2 抗钙超载作用和清除自由基 细胞内Ca2+是造成心肌细胞损伤的重要因素,且其浓度和细胞受损程度密切相关［21］。药理学研究证实,复方丹参滴丸中的丹参酮可抑制动脉平滑肌细胞电压依赖性钙通道及受体门控型钙通道,发挥扩血管效应［22］。三七中的人参皂苷能抑制细胞外钙离子内流和释放,非选择性地抑制钙离子激动所致的心肌收缩,防止钙超载［23］；此外,冰片可通过扩张冠状动脉增加冠脉血流量,缓解心肌缺血［24］。冠心病患者心肌组织缺血缺氧,OFR 生成增多,导致血浆中LPO 增高。采用丹参治疗后,LPO明显降低,提示丹参对于外源性OFR 能起到良好的清除作用。此外,丹参中主要含有丹参素、维生素E 和硒。其中丹参素可明显增强SOD 和谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)活性,维生素E 是有效的抗氧化剂,硒是GSH-Px 的重要组成成分且可加强维生素E 的抗氧化作用。另外,复方组分中的三七皂苷也具有一定的抗氧化能力进而保护组织细胞［25］。

3.3 调控细胞自噬 自噬是一个高度保守的细胞自我代谢过程,在机体处于饥饿、能量缺乏及代谢应激时将衰老、损伤的细胞器或错误折叠的蛋白转运至溶酶体进行降解,再将降解物供机体利用,维持细胞内环境的稳定［5］。当心肌在一定程度的缺血再灌注的条件下,心肌细胞能量缺乏,Ca2+超载,活性氧自由基增多,触发自噬的发生［26］。目前大部分的研究表明自噬的上调和细胞膜的完整、线粒体膜电位的稳定、延迟不可逆细胞损伤的启动等密切相关,同时自噬的上调可清除受损的细胞器,为心肌细胞提供代谢所需的能量和物质,减轻缺血再灌注对心肌的损伤。实验证明,经缺血再灌注处理后的大鼠心肌细胞因自噬的缺失会导致心肌病变［13,27］。而通过敲除抑制自噬的相关基因后发现,自噬的增强能够减轻缺血再灌注大鼠心肌细胞的凋亡,同时很好的改善远期心脏的重构［27］。在Ca2+诱发心肌细胞自噬方面,有文献报道钙再灌注期线粒体的Ca2+超载可诱导心肌细胞的自噬活性,加重心肌细胞的损伤。而复方丹参滴丸中的丹参素有阻滞Ca2+通道、三七总皂苷有拮抗Ca2+的作用,由此推测复方丹参滴丸有可能通过降低心肌细胞内的Ca2+含量来影响自噬作用。此外还有学者发现一些炎症因子对自噬也有调控作用,如 白细胞介素6(IL-6)的过度表达会通过支持人支气管上皮细胞中的Beclin1 和抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1 之间的相互作用阻碍自噬的发生［28］。而实验表明,复方丹参滴丸能有效地降低急性心肌梗死患者血清 IL-6 水平,抑制炎症反应［29］,由此认为复方丹参滴丸可能通过调节炎症因子来影响心肌自噬作用,从而改善心肌缺血再灌注损伤。王学莉等［30］观察复方丹参滴丸对 I/ R 模型大鼠的心肌细胞内游离钙浓度、SOD 和丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量影响试验中发现,复方丹参滴丸在整体和细胞水平均能降低 MRI 大鼠复氧复糖心肌细胞内游离钙荧光强度、提高SOD 活性(P＜0.01)、减少 MDA 生成,并适当增加 NO 含量(P＜0.01)。说明复方丹参滴丸既保护内源性SOD 活力,又能减轻心肌细胞膜LPO 的损伤,从而增强了心肌细胞的抗OFR 损伤能力,保持心肌细胞膜结构的完整性,避免了心肌细胞内Ca2+超载及减少心肌细胞不可逆性损伤。

4 小结

复方丹参滴丸是根据现代医学技术和中医传统理论研制而成的一种中药滴丸剂,是首个通过美国FDAⅢ期临床试验的中成药。目前复方丹参滴丸用于冠心病尤其是I/R 损伤治疗的分子机制尚未完全清楚,涉及多种炎症因子、转录因子、细胞因子、凋亡相关蛋白、生长因子以及生物酶等多种生物因子的调控,间接说明复方丹参滴丸是通过多靶点作用起到改善心肌缺血再灌注损伤的作用。相信随着更多越来越深入的基础研究及高质量、大规模的临床研究的开展,复方丹参滴丸对于I/R 的作用机制将不断完善。