CX3CR1通过调节Ca2+内流介导神经元凋亡影响缺血性卒中小鼠预后

刘 畅，张 申，周菲惠，夏 阳，李智高，王进昆，汤志伟

(昆明医科大学第一附属医院 神经外一科，云南 昆明 650031)

卒中(stroke)是导致中国人致死和致残的主要原因之一。脑缺血发生后，位于脑梗死核心区的细胞由于血流急剧下降，缺血缺氧严重，常在梗死发生数分钟内发生致命性损伤，继而坏死。在梗死核心区与正常脑灌注组织之间有一移行带，即“缺血半暗带”。位于缺血半暗带的神经元常出现继发性损伤,继而出现凋亡, 增加梗塞面积和加重神经功能损伤。诱导细胞凋亡的通路包括内源性和外源性两条。外源性通路主要通过死亡受体介导；内源性通路主要由钙离子(Ca2+)内流增加介导、以线粒体损伤为核心、继而导致凋亡[1]。减少缺血半暗带神经元的凋亡是治疗卒中的有效手段之一。

趋化因子配体(fractalkine; chemokine CX3C motif ligant 1,CX3CL1)及趋化因子受体(fractalkine receptor; chemokine CX3C motif receptor 1,CX3CR1)系统已经被证实在中枢神经系统(central nervous system，CNS)中调节神经元和小胶质细胞交流方面起到重要的作用。同时有研究报道，敲除CX3CR1可以减少脑缺血后神经元的凋亡，并改善神经功能损伤的预后[2]。其主要机制是CX3CR1可调节脑缺血后小胶质细胞的增殖和炎性反应因子释放。而神经元是否有CX3CR1 的表达目前有不同的观点，有研究认为CX3CR1主要集中在小胶质细胞上并不在神经元表达[3]，但也有报道显示CX3CR1不仅在小胶质细胞和星形胶质细胞表达，也在神经元表达[4]，且在某些条件下表达上调，如在大鼠癫痫模型中，CX3CR1在神经元上短暂的表达上调，且用抗体中和CX3CR1后, 可减少癫痫持续状态后神经元的凋亡[5]。但脑缺血后神经元CX3CR1是否表达上调，及其是否调节神经元的凋亡目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级野生型C57/BL6小鼠和CX3CR1基因敲除小鼠，雄鼠，体质量20～25 g[Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)]。所有的实验程序都得到了动物护理和使用机构委员会的批准(文号：KMMU2019068)。

1.1.2 主要试剂：CX3CR1抗体和anti-beta actin(Santa Cruz公司)；DAB、NeuN(Millipore公司)；cleaved-caspase-3(Cell Signaling Technology公司)；rabbit IgG (Vector Laboratories,Burlingame公司)；Fluo-3/AM、MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒、胰蛋白酶(Gibco公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠分组及处理：将小鼠分为对照组(假手术组，n=6)，野生型C57/BL6小鼠永久性大脑中动脉闭塞(permannet middle cerebral artery occlusion,pMACO)模型组(大脑中动脉线栓法，n=15)和CX3CR1基因敲除小鼠pMACO模型组(大脑中动脉线栓法，n=15)。术后放入动物饲养恒温箱保暖，单独饲养，每日两次腹腔注射0.9%氯化钠溶液1 mL，用Longa评分法进行神经功能评分。建模成功后于30 min用7.0T磁共振成像(MRI)行表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)扫描，代表缺血范围，24 h行T2加强像扫描，代表梗死面积。

1.2.2 原代神经元培养：对野生型C57/BL6小鼠和CX3CR1基因敲除小鼠的原代神经元进行培养。取24 h内出生的小鼠，取出脑组织，在解剖液中分离出大脑皮层，仔细剥离脑膜。剪碎的脑组织用0.25%胰蛋白酶轻柔混匀，在37 ℃培养箱中消化11 min，取出，加入2倍体积的终止液，将组织转移至10 cm的无菌培养皿并置于冰袋上，用巴斯德管反复吹打，静置后收集上清液，用70 μm细胞筛网过滤，于血球计数板上计数细胞。调整细胞悬液的浓度，接种到多聚赖氨酸包被过的培养皿中。放入37 ℃培养箱培养，4 h后将接种液换为神经元培养液，以后每3 d半量换液，培养至第10～11天，神经元的纯度可达95%以上，然后进行实验。

1.2.3 氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)处理：神经元培养至第10～11天吸出神经元培养基，加入无糖neurobasal-A，放入缺氧小室，并以10 L/min充入混合气体(95% N2+5% CO2)10 min后封闭，再将缺氧小室置于37 ℃培养箱中，15 min后取出然后进行后续实验。

1.2.4 兴奋性毒性检测：将实验分为CX3CR1+/+、CX3CR1-/-、anti-CX3CR1、anti-IgG组，加入谷氨酸进行兴奋性刺激，然后根据MTT试剂盒提供的方法测量细胞活率，在酶标仪490 nm处测量吸光度值。

1.2.5 Western blot检测脑组织中CX3CR1的表达：提取脑组织蛋白，以BCA法测定总蛋白浓度。用anti-CX3CR1(1∶300)、anti-beta actin(1∶1 000),作为一抗。用Li-Cor Odyssey CLx Imaging System(LI-COR Inc.Lincoln, NE, USA)对条带进行分析。

1.2.6 免疫组化和免疫荧光三重染色法检测凋亡：在免疫组化中先对小鼠大脑用多聚甲醛行灌注处理，用CX3CR1/NeuN阳性细胞的来评价缺血后神经元中CX3CR1的表达情况。用CX3CR1/caspase-3/NeuN阳性细胞的数量来评价神经元的凋亡情况。在免疫荧光三重染色法中，用CX3CR1/caspase-3/MAP-2阳性细胞来评价神经元的凋亡。每组标本中随机选取5个不重叠高倍视野 (×200),用 ImageJ对结果进行分析。

1.2.7 Ca2+显像：神经元培养至第10天，在谷氨酸预处理后,用激光共聚焦显微镜检测细胞内的Ca2+浓度，细胞内Ca2+浓度的高低用荧光信号的强度来衡量。激光共聚焦显微镜以488 nm激发，用530 nm波长发射，每秒钟拍摄一张细胞图片，记录240 s。每个细胞的荧光强度代表了细胞内Ca2+的浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 原代神经元上表达CX3CR1，且OGD后表达上调

C57/BL6新生小鼠的培养原代神经元，CX3CR1在具有MAP-2(神经元特异性标志物)的细胞中有表达，因此确定了CX3CR1在神经元中有表达(图1A)。与对照组相比，神经元在OGD后CX3CR1显著升高(P<0.05)(图1A,B)。

A.expression of CX3CR1 in neurons was significantly increased after OGD(×200); B.expression of CX3CR1 protein was significantly increased after OGD；*P<0.05 compared with control

图1 OGD后神经元中CX3CR1的表达情况

2.2 pMCAO后小鼠患侧神经元CX3CR1表达上调

患侧24 h后CX3CR1表达升高明显(图2A，B)。与对照组相比NeuN和 CX3CR1两者同时表达在大多数患侧神经元上，证实了患侧神经元CX3CR1表达升高(图2C)。患侧与正常组和健侧相比CX3CR1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)(图2D)。

2.3 敲除CX3CR1可以减少脑缺血后梗死面积和神经功能障碍

pMACO 30 min后野生型小鼠 (CX3CR1+/+)与CX3CR1基因敲除小鼠(CX3CR1-/-)的缺血面积并无显著差异(图3A)。pMACO 24 h后，野生型小鼠(CX3CR1+/+)与CX3CR1基因敲除小鼠(CX3CR1-/-)相比梗死面积显著大于基因敲除鼠(P<0.05)(图3B)；与基因敲除鼠相比，野生型小鼠(CX3CR1+/+)缺血区96.7%的面积发生了梗死，而CX3CR1基因敲除小鼠(CX3CR1-/-)只有71.9%(P<0.05)(图3C)。pMACO 24 h后，野生型小鼠与基因敲除鼠相比平均临床得分为3.8±0.4，而基因敲除鼠为2.8±0.3 (P<0.05)(图3D)。

2.4 CX3CR1介导了神经元凋亡的过程

与正常组和健侧相比，CX3CR1/cleaved-caspase-3同时表达在大多数患侧神经元上 (图4A)。患侧与正常组和健侧相比cleaved-caspase-3/CX3CR1/NeuN三重染色的阳性细胞显著升高(P<0.05)(图4B)。

2.5 CX3CR1基因敲除小鼠可以通过减少Ca2+内流从而对谷氨酸诱导的神经元凋亡起保护作用

与经过谷氨酸处理后的CX3CR1+/+小鼠神经元和加入anti-IgG组相比，CX3CR1-/-小鼠神经元和加入CX3CR1抗体预处理组Ca2+内流显著降低(图5A)。与CX3CR1+/+组相比，基因敲除组和CX3CR1抗体预处理组Ca2+超载显著降低(P<0.05)。与加入anti-IgG组相比，CX3CR1抗体预处理组Ca2+超载显著降低(P<0.05)(图5B)。

A.Staining of CX3CR1 in cerebral cortex(×200)，*P<0.05 compared with control and contralateral；B.semi-quantitative analysis of CX3CR1 expression between groups; C.double staining of CX3CR1/NeuN between two groups(×200)；D.expression of CX3CR1 protein in each group

图2 在pMACO小鼠中梗死大脑半球CX3CR1的表达情况

A.ADC and MRI images 30 min after pMACO; B.ischemic area and infarct area after 24 hours；C.semi dark band condition; D.neurologic scoring;*P<0.05 compared with CX3CR1+/+mouse

图3 敲除CX3CR1可以减轻pMACO 后梗死面积以及神经功能障碍

A.cleaved-caspase3 (apoptotic marker)/CX3CR1/NeuN (neuronal marker)triplicate staining(×200); B.positive cells in triple staining of caspase3/CX3CR1/NeuN;*P<0.05 compared with control and contralateral

图4 CX3CR1诱导神经元凋亡的相关性研究

A.intergroup calcium influx(×200)；B.Ca2+fluorescence intensity between each group;*P<0.05 compared with CX3CR1+/+group and anti-IgG group

图5 敲除CX3CR1对谷氨酸处理后神经元Ca2+浓度的影响

2.6 敲除CX3CR1可提高谷氨酸处理后神经元的存活率

与CX3CR1+/+相比，加入谷氨酸后CX3CR1+/+小鼠神经元的存活率显著降低(P<0.01)。用谷氨酸处理后，与CX3CR1+/+小鼠相比，CX3CR1-/-小鼠和加入CX3CR1抗体预处理的神经元存活率明显升高(P<0.01)。与CX3CR1抗体预处理组相比，anti-IgG组神经元存活率显著更低(P<0.01)(图6)。

3 讨论

在不同的疾病过程中CX3CR1发挥着不同的作用。动脉粥样硬化中CX3CR1可以抑制单核细胞/内皮细胞黏附，从而减轻动脉粥样硬化[6]，在阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)中，缺失CX3CR1可影响Tau蛋白的代谢而发挥保护作用[7]，而在实验性自身免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型中，缺失CX3CR1可加重神经功能损害[8]。在脑缺血模型中，敲除CX3CR1基因可以改善脑缺血的预后[2]，与本研究的结果一致。但之前的研究大量集中在CX3CR1在小胶质细胞和星形胶质细胞中的表达[9]，以及神经元和小胶质细胞间通过CX3CL/CX3CR1轴的相互作用，本研究主要集中在脑缺血后神经元CX3CR1的表达变化及其对神经元凋亡的调节上。

神经元CX3CR1的表达在不同条件下会发生改变。本研究发现了CX3CR1在正常脑组织中处于低水平，但是在脑缺血后显著上升。有报道显示，癫痫也可导致CX3CR1在神经元中短暂的表达上调[5]。而癫痫也会导致大脑的缺血缺氧[10]，提示缺血缺氧可能是诱导神经元CX3CR1表达上调的重要原因。神经元中的CX3CR1对神经元的存活具有调节作用。有研究发现，海马神经元上的CX3CR1受体具有功能性表达，且其参与了gp120蛋白对神经元毒性的保护作用[11]，而本研究结果显示敲除神经元CX3CR1可在缺血状态下发挥保护作用。也有报道显示在癫痫模型中，CX3CR1的介导神经元的退行性作用，抗体中和CX3CR1可减少神经元的凋亡[5]。这些结果的不一致，可能是在不同的条件下，CX3CR1激活的信号通路不一样。有报道显示神经元上CX3CR1受体可通过Akt和NF-κB及其下游信号通路来发挥神经营养作用[11]，但也同时参与ERK信号通路介导神经元的凋亡[12]。因此，神经元CX3CR1介导的促凋亡和促生存信号通路之间可能存在大量的“串扰”，这些值得以后在神经元缺血损伤中做更深入的研究。

图6 敲除CX3CR1对谷氨酸处理后神经元存活率影响

Fig 6 Effect of CX3CR1 knockout on neuronal survival after glutamate treatment

兴奋性毒性是脑缺血损伤的主要机制之一，高浓度的谷氨酸对神经元的持续性刺激以及局部能量的耗竭是神经元死亡的原因之一。谷氨酸会激活突触和突触外的谷氨酸离子受体，细胞内的钙和钠会导致神经元长期去极化和破坏细胞膜的稳态[13]。在之前的一项研究中，通过电流钳记录了缺血中神经元兴奋性和突触兴奋性传递[14]。研究表明CX3CR1参与介导Ca2+向细胞内流增加[11]，而阻断人源胚胎肾细胞系HEK293的CX3CR1受体可阻断Ca2+内流到细胞[15]。也有报道显示，敲除CX3CR1基因可以保护amyloid-β 诱导产生的兴奋性毒性[3]。在本研究中，敲除CX3CR1基因可以通过减少Ca2+的内流从而减轻谷氨酸造成的兴奋性毒性，与之前的报道具有相似性，提示神经元上CX3CR1受体可介导Ca2+向细胞内流。

综上所述，本研究证实了脑缺血后神经元CX3CR1的表达升高，而敲除CX3CR1后可以对神经元起到保护作用，其机制是通过调节Ca2+的内流来实现的，这为将来脑缺血的治疗提供一个新的思路。