戊酸雌二醇改善多囊卵巢综合征大鼠氯米芬诱导的子宫内膜容受性

邵锐锋，何驰华，王 莹

(荆州市中心医院 生殖医学科, 湖北 荆州 434000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是造成女性不孕的重要原因之一。PCOS每年新发病例约占育龄女性的10%，占无排卵性不孕患者总例数的75%，给女性身心健康造成严重影响。氯米芬(clomiphene)属于PCOS临床一线促排卵药物，但由于其抗雌激素作用，常引起子宫内膜容受性降低，导致排卵率高但妊娠率低的现象[1]。戊酸雌二醇(estradiol valerate，E2V)具有促进子宫内膜生长的作用，但关于其对应用氯米芬促进PCOS排卵时子宫内膜的影响及调控机制尚未阐明。本研究通过应用不同剂量E2V对PCOS氯米芬促排卵SD大鼠干预，观察其对子宫内膜形态改变，并重点探讨调控机制，为临床用药提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

E2V(拜耳医药保健有限公司，规格1 mg);柠檬酸氯米芬胶囊(广州康和药业有限公司，规格50 mg);性激素检测相关酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司);兔抗大鼠雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progester-one receptor，PR)、同源框基因(homeobox gene，Hox)A10、空通气孔同源框(empty ventilator homeobox，Emx)2、整合素(integrin)αvβ3单抗、山羊抗兔ER、PR、HoxA10、Emx2、integrin αvβ3多抗(Santa Gruz公司)。50只SPF级雌性SD大鼠，21 d龄，体质量(75±5)g[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2017-0001]。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠分为对照组(0.9%氯化钠溶液灌胃)、PCOS模型组(50 mg/kg氯米芬灌胃，70 d龄开始，采用皮下注射脱氢表雄酮麻油溶液法建立PCOS模型，用阴道涂片法监测发情周期，连续2个动情周期以上阴道角化细胞即建模成功)、E2V低、中和高剂量干预组[(0.2、0.5、1.0)mg/kg E2V+50 mg/kg氯米芬灌胃，1次/d，连续5 d]。

1.2.2 ELISA检测血清性激素水平：末次灌胃后2 h尾静脉取血2 mL，3 000 r/min离心10 min，常规分离血清，用ELISA试剂盒检测大鼠血清性激素：卵泡生成激素(follicle-forming hormone，FSH)、黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、睾酮(testosterone，T)水平。

1.2.3 子宫内膜形态学变化：末次灌胃后2 h，戊巴比妥钠麻醉后仰卧位固定大鼠，切开腹部取完整子宫(大鼠为双子宫)，取左侧子宫放于4%多聚甲醛中固定，常规梯度脱水、包埋，并制作4 μm连续切片，用常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，测量子宫内膜厚度、腺体及腺腔面积、腺/间质面积比。

1.2.4 实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测mRNA表达：取右侧子宫内膜75 mg，剪碎后以Trizol法提取组织总RNA。反转录获得cDNA，鉴定后以cDNA为模板进行RT-qPCR，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，重复42个循环，以β-actin为管家基因，2-△△Ct为目的基因的相对表达强度。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达：取右侧子宫内膜75 mg，研磨后加入500 μL细胞裂解液，沸水浴10 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液进行蛋白定量。取50 μg样品加入等体积上样缓冲液混匀后，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min取上清液，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，电转90 min，加入封闭液摇床封闭2 h，加入一抗(1∶800)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶8 000)，常温孵育2 h，暗室中曝光。用凝胶成像分析系统扫描并定量分析，目的蛋白与内参β-actin吸光度值比值即蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 阴道涂片结果

发情前期阴道脱落细胞多呈椭圆或圆形、较大，发情后期多呈多边形角质化上皮细胞，发情间期为红细胞和白细胞，建模成功大鼠失去完整发情周期，阴道涂片显示处于发情间期(图1)。

2.2 血清性激素水平变化

血清LH/FSH、T比较：对照组

2.3 子宫内膜形态学变化

不同干预组大鼠子宫内膜厚度、腺体面积等变化不一；腺体面积、腺腔面积、子宫内膜厚度及腺/间质面积比比较：对照组>E2V高剂量干预组>中剂量>低剂量>PCOS模型组(P<0.05)(表2，图2)。

图1 发情前期、发情后期和发情间期的阴道涂片

表1 血清性激素水平变化

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with PCOS;△P<0.05 compared with low-dose E2V;▲P<0.05 compared with medium-dose E2V.

表2 子宫内膜形态学变化

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with PCOS;△P<0.05 compared with low-dose E2V;▲P<0.05 compared with medium-dose E2V.

2.4 ER、PR、HoxA10、Emx2、integrin αvβ3 mRNA表达

ER、PR、HoxA10、integrin αvβ3mRNA相对表达量比较：对照组>E2V高剂量干预组>中剂量>低剂量>PCOS模型组(P<0.05)；Emx2 mRNA相对表达量比较与上述结果相反(P<0.05)(表3)。

2.5 ER、PR、HoxA10、Emx2、integrin αvβ3蛋白表达

ER、PR、HoxA10、integrin αvβ3蛋白相对表达量比较：对照组>E2V高剂量干预组>中剂量>低剂量>PCOS模型组(P<0.05)；Emx2蛋白相对表达量比较与上述结果相反(P<0.05)(表4，图3)。

3 讨论

氯米芬可通过与下丘脑细胞ER结合，阻断E2对下丘脑的负反馈作用，促进雌激素分泌而达到促进PCOS患者排卵。氯米芬可通过雌激素受体途径、线粒体途径等多种途径抑制子宫内膜增殖，引起子宫内膜细胞凋亡增加、发育迟缓，影响子宫内膜容受性。氯米芬促PCOS排卵成功率可达85%，而临床妊娠成功率仅为40%左右，此种情况与氯米芬抗雌激素、弱激素作用导致的子宫内膜容受性降低有关。少量E2V与氯米芬联用可刺进子宫内膜生长，有效提高临床妊娠率[2]，但其调控机制尚未明确。E2V在肝脏中代谢为E2与戊酸，E2与相应受体结合作用于子宫内膜、促进其增殖，子宫内膜厚度及腺/间质面积比相应增加，子宫内膜容受性增加[3]。本研究应用E2V与氯米芬共同干预PCOS大鼠与单独应用氯米芬干预相比，LH/FSH、T水平均有不同程度降低，E2水平下调，提示E2V可改善子宫内膜容受性。

图2 各组大鼠子宫内膜HE染色

表3 ER、PR、HoxA10、Emx2、integrinαvβ3 mRNA相对表达量

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with PCOS;△P<0.05 compared with low-dose E2V;▲P<0.05 compared with medium-dose E2V.

表4 ER、PR、HoxA10、Emx2、integrin αvβ3蛋白相对表达量

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with PCOS;△P<0.05 compared with low-dose E2V;▲P<0.05 compared with medium-dose E2V.

图3 大鼠各组子宫内膜相关蛋白的表达

ER、PR分别介导雌激素和孕激素对子宫内膜作用，参与调控子宫内膜容受性、促进蜕膜的生长发育及子宫内膜黏附状态的形成，是胚泡着床的重要调控因子。HoxA10是多基因转录调控基因，在胚胎发育、蜕膜生成及子宫内膜容受性等方面起重要作用[4]。Emx2是HoxA10下游基因，HoxA10通过与Emx2调控区结合发挥生殖道发育负调控作用，与子宫内膜增殖呈显著负相关[5]。integrin αvβ3是黏附分子家族重要成员之一，在细胞增殖、迁移及凋亡等多种生物学活动中扮演重要角色。integrinαvβ3同样是HoxA10下游基因，其基因5′端有多个HoxA10结合位点，性激素可通过HoxA10上调integrin αvβ3表达，进而增强受精卵附着能力，进而改善子宫内膜容受性[6]。本研究应用E2V联合氯米芬干预PCOS大鼠后，ER、PR、HoxA10、integrinαvβ3mRNA和蛋白表达上调,Emx2 mRNA和蛋白下调，提示E2V可通过HoxA10途径改善子宫内膜容受性。

总之，E2V可显著改善PCOS氯米芬促排卵的SD大鼠模型子宫内膜容受性，推测与调控相关基因和蛋白表达有关，提示临床中可应用E2V改善氯米芬对PCOS患者子宫内膜容受性的抑制作用，提高妊娠率。