尼古丁促进高糖/高脂培养的大鼠心肌细胞系H9C2凋亡

刘雯霞，刘彩红，郭 蕊，孟芝君，高 佳，王亚静

(山西医科大学 基础医学院, 山西 太原 030000)

尼古丁(nicotine, Nic)是香烟的主要成分，是心血管疾病、慢性阻塞性肺病和肺癌的主要危险因素[1]，它可以引起心肌细胞凋亡[2]，导致心肌收缩功能障碍、心脏肥大和心肌纤维化[5]。重度吸烟者患2型糖尿病的风险显著增加[3]。高血糖通过诱导与内质网应激相关的细胞凋亡引起心脏损伤[4]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路与心肌细胞凋亡的发生发展密切相关[6]。但在高糖/高脂(high glucose/high fat,HGHL)条件下，尼古丁对心肌细胞凋亡的影响研究甚少。本实验探讨尼古丁对高糖/高脂培养的H9C2细胞凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞系H9C2(中国科学院典型培养物宝藏委员会细胞库);DMEM高糖培养基﹑0.25%胰蛋白酶﹑青链霉素和CCK8细胞增殖与毒性检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒和ROS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；尼古丁(nicotine，Nic)(Sigma-Aldrich公司)；cleaved-caspase3、caspase3、p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK抗体(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组：将1×105个/mL的H9C2细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度达到80%时，进行后续实验。

将细胞分为对照组、不同浓度Nic(6×10-8、6×10-7和6×10-6mol/L)组、HGHL(33 mmol/L葡萄糖和500 μmol/L 棕榈酸脂)组、尼古丁联合高糖/高脂(6×10-8、6×10-7和6×10-6mol/L Nic+HGHL)组。

尼古丁处理2 h，高糖/高脂24 h进行检测；抑制剂组提前30 min加入ERK1/2抑制剂(PD98059)或者N-乙酰半胱氨酸，ROS清除剂(N-acetyl-L-cysteine，NAC)后进行上述处理。

1.2.2 CCK8法检测细胞增殖与毒性：将H9C2细胞接种于96孔板中(5 000个/孔)，每孔加10 μL的CCK8试剂，培养板在培养箱内孵育1～4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

1.2.3 LDH试剂盒检测细胞活性：将H9C2细胞接种于6孔板中(2×105个/mL)，按照LDH试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 流式细胞计量术检测细胞ROS及细胞凋亡：取对数增殖期细胞，每1 mL培养基加入1 μL DCFH-DA储存液，37 ℃孵育30 min，去除工作液，用常温PBS液洗3次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集，加1 mL PBS重悬，上机，用500 nm的激发波长根据荧光强度测定细胞内ROS水平。

取对数增殖期的细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测。细胞凋亡率用早凋和晚凋和表示。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关caspase3、Bax、Bcl-2及MAPK蛋白表达：取对数增殖期细胞，干预处理，弃掉培养基，加裂解液，BCA法测定蛋白样品浓度，用4%～12% SDS-PAGE电泳转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 抗4 ℃过夜，用TBST缓冲液洗膜，后在抗兔IgG二抗中孵育，在TBST洗涤缓冲液洗膜，用增强化学发光(ECL)孵育曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 尼古丁、高糖/高脂对H9C2细胞增殖和LDH漏出量的影响

与对照组相比，HGHL组与尼古丁联合HGHL组细胞存活率显著降低(P<0.001)，上清液中LDH浓度明显增加(P<0.01)；与HGHL组相比，6×10-6mol/L Nic+HGHL组，上清液中LDH浓度显著增加(P<0.001)(图1)。选择6×10-7mol/L尼古丁(与一般吸烟人群血液尼古丁浓度相近)进行后续机制研究。

2.2 尼古丁与高糖/高脂对H9C2细胞凋亡的影响

与对照组相比，HGHL组与Nic+HGHL组细胞凋亡率明显增加，与HGHL组相比，Nic+HGHL组细胞凋亡显著增加(P<0.001)(图2A)。HGHL和Nic+HGHL，Bcl-2/Bax蛋白表达显著下降,而cleaved-caspase3蛋白表达明显增加(P<0.001)；与HGHL相比，Nic+HGHL组，cleaved-caspase3蛋白表达增加(P<0.05)(图2B)。

*P< 0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with HGHL group

A.apoptosis rate was detected by flow cytometry；B.the protein expression of Bcl-2,Bax and caspase3 was detected by Western blot；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control group；#P<0.05 compared with HGHL group

图2 尼古丁与高糖/高脂对H9C2细胞凋亡的影响

2.3 尼古丁与高糖/高脂导致氧化应激

与对照组相比，尼古丁和高糖/高脂组细胞内ROS表达增加(P<0.05)，Nic+HGHL组，细胞内ROS表达显著增加(P<0.001(图3)。

2.4 尼古丁与高糖/高脂增加ERK1/2的激活

与对照组相比，HGHL组p38、JNK和ERK1/2磷酸化蛋白表达明显增加(P<0.05)；而HGHL组与Nic+HGHL组ERK1/2磷酸化水平显著增加(P<0.01)(图4)。

2.5 ERK1/2抑制剂和ROS清除剂对细胞凋亡的影响

与HGHL组相比，HGHL+PD98059，Nic+HGHL+PD98059中caspase3 蛋白表达显著升高(P<0.001)，而HGHL+NAC组与Nic+HGHL+NAC组,caspase3蛋白表达显著降低(P<0.001)(图5)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with HGHL group

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group

3 讨论

摄入过多卡路里、滥用酒精及烟草，增加了糖尿病的发病率和并发症[7]。心肌细胞凋亡被认为是缺血性或非缺血性心脏病的重要机制[8]。尼古丁通过氧化应激诱导细胞凋亡是通过刺激caspase-2介导的内源性凋亡途径[9]；高糖诱导心肌细胞系H9C2的多种损伤作用，包括细胞毒性，细胞凋亡及线粒体损等[10]。本实验发现，高糖/高脂与尼古丁联合高糖/高脂cleaved-caspase3活化以及Bax/Bcl-2 比率显著增加，尼古丁与高糖/高脂共同作用能增加H9C2细胞凋亡。

氧化应激与各种细胞，包括心肌细胞的凋亡信号的转导密切相关[11]。它是糖尿病性心脏病发生和发展的关键因素，ROS的增加在高葡萄糖诱导的心肌细胞凋亡中起重要作用[12]。有报道ROS可以促进细胞增殖、迁移、死亡和凋亡等细胞功能[13]。本研究发现，尼古丁和高糖/高脂均能增加氧化应激，而尼古丁联合高糖/高脂能产生更强的氧化应激。然而，单纯尼古丁，尽管氧化应激显著增加，但细胞的凋亡率变化不明显，表明仅由尼古丁引起的氧化应激不足以引发心肌细胞凋亡，这与文献报道一致[11]。

高血/糖能显著增加p38 MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的磷酸化水平[14]。MAPK信号家族在细胞凋亡的调控中发挥重要作用[6]。本实验发现，高糖/高脂可增加p38 MAPK、ERK1/2和JNK的磷酸化，而尼古丁联合高糖/高脂条件下，ERK1/2磷酸化升高水平更明显。提示MAPK家族成员ERK1/2在尼古丁联合高糖/高脂引起的细胞凋亡过程中有重要作用。

综上所述，本实验证明了尼古丁与高糖/高脂减弱H9C2细胞的增殖，增加LDH活力及细胞凋亡，ROS产生增多和ERK1/2磷酸化水平增加在心肌细胞凋亡中具有重要作用。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with HGHL group