巯基化Ras相关蛋白7a抑制人肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV复制

宋佳茹，朱席琳，伍晓盼，刘 英

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV)感染一直是全球重大的健康疾病问题。尽管从90年代初就建立了HBV疫苗计划，许多国家HBV感染的新发病率下降明显，有效的抗病毒治疗也能够长期抑制HBV的复制，但仍有2.4亿人携带乙型肝炎病毒，并有发展为肝硬化和肝癌的风险[1]。

硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)通过将靶蛋白的游离巯基(-SH)转变为硫巯基基团(-SSH)的巯基化修饰，影响众多靶蛋白的功能[2]，包括肿瘤抑制蛋白Keap1、转录RUNX2以及parkin蛋白等[3-4]。H2S作为一种重要的内源性气体信号分子，可以减轻刀豆蛋白A诱导的肝炎损伤[5]；并在肝脏缺血再灌注损伤中起到抗感染和保护细胞作用[6]。然而，H2S诱导的巯基化修饰对于HBV复制的影响尚未见报道。因此，本研究探究HepG2.2.15细胞中H2S对Ras相关蛋白7a (Ras related protein 7a, Rab7a)的巯基化修饰作用，及其对HBV复制的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：HBV阳性人肝癌细胞系HepG2.2.15(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 试剂与抗体:MEM Alpha培养基及胎牛血清(Gibco公司)；兔抗Rab7a抗体(Affinity公司)；山羊抗兔IgG、Ultrapure RNA kit(北京康为世纪生物科技有限公司)；RNA反转试剂盒(TOYOBO公司)；乙型肝炎病毒e及s抗原检测试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司)；DNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)；LipofectamineTM3000(Thermo Fisher公司); NaHS(Sigma-Aldrich公司); GYY4137(Santa Cruz公司); DTT(Genview公司)。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建：Rab7a-wt质粒及Rab7a-mut质粒由上海捷瑞生物工程有限公司构建，质粒载体为LV-efla。Rab7a-mut质粒为Rab7a-wt质粒中83、84及143位半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)，测序正确后进行转染。

1.2.2 转染细胞及试剂使用方法：按LipofectamineTM3000说明书操作，转染48～72 h后收集细胞或者上清液，收集细胞前1 h加入200 μmol/L NaHS或1 mmol/L DTT。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达：转染48 h后提取各组总蛋白，12% SDS-PAGE分离蛋白后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用抗Rab7a(1∶1 000)、抗HBc(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶10 000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，采用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，ECL发光液显影，用Image J软件分析目的蛋白Rab7a和HBcAg的相对表达量。

1.2.4 生物素转换实验检测巯基化蛋白：常规提取蛋白，加入含MMTS(甲基硫代磺酸甲酯)封闭液置于50 ℃水浴锅中封闭20 min，用丙酮进行蛋白沉淀，用HESN(250 mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸，1 mmol/L 乙二胺四乙酸, 0.1 mmol/L新亚铜试剂, 1%十二烷基硫酸钠)重悬蛋白并加入biotin-HPDP{N-(6-[生物素胺]己基)-3-(2-吡啶二硫)丙酰胺}避光孵育75～90 min，使蛋白生物素化，向溶液中加入链霉素亲和珠4 ℃过夜孵育，用Western blot检测目标蛋白。

1.2.5 ELISA检测HBsAg和HBeAg：转染3 d后，将细胞培养基按抗原检测说明书操作检测HBsAg和HBeAg，设置酶标仪波长于450 nm处读取数值。

1.2.6 HBV-DNA和cccDNA的提取：转染后72 h，收集细胞上清液，按一管式病毒DNAout提取试剂盒步骤提取HBV-DNA；细胞用苯酚-氯仿抽提法提取DNA，在DNA中加入ATP依赖性质粒安全DNA酶去除线性双链基因组DNA，将处理好的共价闭合环状DNA(covalent closed circular DNA,cccDNA)为模板用于RT-qPCR检测。

1.2.7 HBV 3.5 ku RNA和total RNA的提取及反转：使用Ultrapure RNA kit提取细胞总RNA，并使用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度，进行反转录得到cDNA。

1.2.8 RT-qPCR：体系配置、引物使用及RT-qPCR程序见引文[7]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HepG2.2.15细胞中H2S对内源性Rab7a巯基化的作用

DTT(还原剂)组没有检测到内源性Rab7a巯基化表达，NaHS(H2S速释供体)组较对照组内源性Rab7a巯基化表达升高(P<0.01)(图1A)。GYY4137(H2S缓释供体)组其内源性Rab7a巯基化表达明显高于对照组(P<0.01)(图1B)。

A.sulfhydration of Rab7a with NaHS or DTT treatment, relative protein level was normalized to Rab7a；*P<0.01 compared with control group; B.sulfhydration of Rab7a with GYY4137 treatment, the relative protein level was norma-lized to Rab7a；*P<0.01 compared with control group

2.2 NaHS对外源性Rab7a巯基化位点的验证

Rab7a过表达的情况下，NaHS处理组Rab7a巯基化表达较非处理组升高(P<0.01)；Rab7a(Δ)(其巯基化位点突变)组较Rab7a组的巯基化水平明显降低(图2)。

sulfhydrylation of Rab7a compared with Rab7a(Δ)with or without NaHS treatment, relative protein level was normalized to Rab7a; *P<0.01 compared with control group

2.3 Rab7a对细胞上清中HBV标志物影响

NaHS处理后Rab7a过表达组细胞上清中HBV DNA、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达明显低于对照组(P<0.05)，Rab7a(Δ)突变组较对照组细胞上清HBV标志物的表达水平无明显差异(图3)。

Expression of HBV markers in cell supernatant concluding HBV DNA, HBsAg and HBeAg; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

2.4 Rab7a对HepG2.2.15细胞中HBV标志物影响

与对照组相比，NaHS处理后Rab7a过表达组细胞中ccc DNA, HBV 3.5 ku RNA和HBV total RNA的表达明显降低(P<0.05)，Rab7a突变后对细胞上清HBV标志物的抑制作用减弱(图4A)。在蛋白水平，Rab7a及其突变质粒有效过表达(P<0.01)(图4B)。NaHS处理后Rab7a过表达较对照组HBcAg蛋白的表达水平减弱(P<0.05)，而Rab7a突变[Rab7a(Δ)]后HBcAg蛋白的表达较对照组无差异(图4C)。

3 讨论

Rab7a属于GTPase家族，以Rab7a GDP和Rab7aGTP两种形式的转换以及Rab7a在胞质和膜之间的转位完成Rab7a对囊泡运输的调控，发挥特有的生物功能。已有报道，在HBV进入细胞初期，Rab5a和Rab7a协助HBV早期内体到晚期内体的转运[8]；而在HBV病毒复制的后期，Rab7a活化形式的过表达抑制HBV病毒的扩增，降低病毒载量，相反,敲低Rab7a能够减少病毒向降解溶酶体的传递，增强HBV的释放[9-10]。本研究中H2S使Rab7a第83、83、和143位半胱氨酸发生巯基化，从而激活Rab7a，巯基化的Rab7a显著降低HBV标志物的表达，发挥抑制HBV的复制的作用。

A.expression of HBV markers in HepG2.2.15 cells concluding ccc DNA, HBV 3.5 ku RNA and HBV total RNA,*P<0.05,**P<0.01 compared with control group; B.Western blot analysis of Rab7a protein expression, relative protein level was normalized to GAPDH;**P<0.01 compared with control group; C.Western blot analysis of HBcAg protein expression, relative protein level was normalized to GAPDH,*P<0.05 compared with control group

图4 Rab7a对HepG2.2.15细胞中HBV标志物的检测

H2S介导的巯基化修饰通过作用于关键半胱氨酸残基，从而调节多种细胞生理病理过程，这也为在HBV相关信号通路和机制研究提供了新的策略。