甲基莲心碱通过调控miR-29a-3p/AQP4表达抑制Aβ1-42致PC12细胞的损伤

曾利敏，鲁召辉，周丽平，朱超霞

(郑州市第七人民医院, 河南 郑州 450000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种典型的渐进式神经退行性疾病，其形成和发展由环境和遗传多种因素综合所致，具体的发病机制仍不明确。β淀粉样蛋白(amyloid β，Aβ)沉积是诱发AD患者神经退行性病变的关键因素[1]，其介导细胞凋亡、炎性级联反应、氧化应激等毒性效应，加剧AD病情[2]。甲基莲心碱(neferine，Nef)是一种异喹啉类生物碱成分，提取自睡莲科植物莲成熟种子胚芽，具有抗健忘、抗抑郁、抗癌、抗炎和抗氧化等生物活性[3]。但甲基莲心碱对AD的影响及其相关的分子机制，这方面的研究鲜见报道。本研究以具有神经源性的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系(pheochromocytomaderived cell line, PC12 cell line)为研究对象，考察甲基莲心碱在β淀粉样蛋白Aβ1-42刺激的PC12细胞模型中的保护作用，并探索其作用机理，为甲基莲心碱应用于阿尔茨海默病提供理论参考，并为阿尔茨海默病的早期诊治提供潜在生物靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系PC12(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；甲基莲心碱(纯度98.6%，成都曼斯特生物科技有限公司)；Aβ1-42、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM培养基、胎牛血清、马血清(Hyclone公司)；Trizol、lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；miR-29a-3p、anti-miR-29a-3p、荧光素酶报告载体(上海吉玛生物有限公司)；miRNA提取试剂盒(Qiagen公司)；反转录试剂盒、qPCR试剂盒(TaKaRa公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物有限公司)；凋亡试剂盒(南京凯基生物公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore公司)；GAPDH、Bcl-2和Bax抗体(Cellular Signaling Technology公司)；辣根过氧化物酶标记二抗(武汉博士德生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与分组：用高糖DMEM培养基，同时加入5%胎牛血清和10%马血清放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养PC12细胞。观察细胞增殖状态，当细胞汇度为80%时，按1∶3比例进行接种传代。将对数期PC12细胞随机分为对照组(Con组)、模型组(Aβ1-42组，4 μg/mL Aβ1-42培养PC12细胞24 h)、低、中和高剂量甲基莲心碱干预组(0.3、1和3 μg/mL Nef干预48 h)，收集PC12细胞用于后续指标检测。

1.2.2 qPCR检测目的基因表达：使用mRNA提取试剂盒提取各组细胞中mRNA，合成cDNA，用以检测mRNA表达水平；采用Trizol试剂裂解各组细胞，提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒反转录成cDNA，以合成的cDNA为模板，用以检测mRNA表达水平。miR-29a-3p上游引物序列为5′-GGGTAGCACCATCTGAA AT-3′,下游引物序列为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。AQP4上游引物序列为5′-CTGGAGCCAGCAT GAATCCAG-3′，下游引物序列为5′-TTCTTCTCTTCTC CACGGTCA-3′。通过实时定量PCR仪进行扩增，扩增程序为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循环40次后确认扩增曲线和熔解曲线，收集Ct值，以2-ΔΔCt法分析相对表达量。

1.2.3 转染细胞：吸取PC12细胞按5×105个/孔接种于6孔板，待其增殖至70%～80%汇合度时开始转染。根据lipofectamine 2000试剂说明书，根据不同的实验目的，在PC12细胞中转染miR-29a-3p、si-AQP4或anti-miR-29a-3p，培养48 h备用。

1.2.4 靶基因预测及双荧光素酶报告基因：生物学信息软件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-29a-3p与水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)的3′UTR区域具有部分结合位点。分别合成野生型AQP4(WT-AQP4)和突变型AQP4(MUT-AQP4)的3′UTR荧光素酶报告基因载体，并分别与miR-29a-3p或相应对照miR-NC共转染，孵育48 h后测定双荧光素酶活性。

1.2.5 Western blot检测AQP4、Bcl-2和Bax蛋白表达：在细胞中加入RIPA裂解液充分提取总蛋白，经10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)分离蛋白，转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭 1h，加入一抗，4 ℃孵育过夜，然后加入Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween, TBST)洗涤3次，每次10 min；加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，在化学发光液中显色、显影，以GAPDH作为对照，分析蛋白相对表达量。

1.2.6 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活：收集细胞接种于96孔细胞板，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)溶液，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃摇床振荡10 min，充分溶解结晶，用酶标仪测定细胞在波长490 nm处吸光度值(A值)，细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1.2.7 细胞凋亡实验：调整各组细胞为1×105个/mL，使用400 μL annexin V缓冲液重悬细胞，随后将其转移到离心管，加入5 μL annexin V-FITC和5 μL PI混匀，于室温避光孵育30 min，上流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Aβ1-42对PC12细胞损伤及miR-29a-3p、AQP4表达的影响

与对照组相比，模型组PC12细胞miR-29a-3p表达量减少(P<0.05)(图1B)，AQP4 mRNA表达量明显升高(P<0.05)(图1C)，AQP4、Bax蛋白表达量显著增加(P<0.05)(图1A，D，F)，而Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.05)(图1A，F)，细胞存活率显著下降(P<0.05)(图1E)，细胞凋亡率明显增加(P<0.05)(图1G，H)。

A.immunoblotting map; B.effect of Aβ1-42 on miR-29a-3p expression in PC12 cells; C.effect of Aβ1-42 on AQP4 mRNA expression in PC12 cells; D.effect of Aβ1-42 on AQP4 protein expression in PC12 cells; E.effect of Aβ1-42 on the survival rate of PC12 cells; F.effect of Aβ1-42 on the expression of apoptosis-related proteins in PC12 cells; G,H.effect of Aβ1-42 on apoptosis rate of PC12 cells;*P<0.05 compared with Con group

图1 Aβ1-42对PC12细胞损伤及miR-29a-3p、AQP4表达的影响

2.2 甲基莲心碱对Aβ1-42致PC12细胞损伤的影响

与Aβ1-42组比较，不同剂量的甲基莲心碱干预明显提高Aβ1-42损伤PC12细胞中miR-29a-3p表达(P<0.05)(图2B)，显著减少AQP4 mRNA表达量(P<0.05)(图2C)，明显降低AQP4、Bax蛋白表达量(P<0.05)(图2A，D，F)，显著增加Bcl-2蛋白表达量(P<0.05)(图2A，F)，以及明显提高细胞存活率(P<0.05)(图2E)，显著减少细胞凋亡率(P<0.05)(图2G，H)，均呈一定的浓度依赖性。

A.immunoblotting map; B.effect of neferine on the expression of miR-29a-3p in PC12 injury induced by Aβ1-42; C.effect of neferine on the expression of AQP4 mRNA in PC12 injury induced by Aβ1-42; D.effect of neferine on the expression of AQP4 protein in PC12 injury induced by Aβ1-42; E.effect of neferine on the survival rate of PC12 cells induced by Aβ1-42; F.effect ofneferine onapoptosis-related protein expression of PC12 cells induced by Aβ1-42;G,H.effect of neferine on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ1-42；*P<0.05 compared with Aβ1-42 group;#P<0.05 compared with Aβ1-42+Nef-L group;△P<0.05 compared with Aβ1-42+Nef-M group

图2 甲基莲心碱对Aβ1-42致PC12细胞损伤的影响

2.3 miR-29a-3p靶向调控AQP4的表达

Targetscan数据库预测miR-29a-3p与AQP4 3′UTR中部分核苷酸存在互补配对现象(图3A)，推测AQP4是miR-29a-3p的靶基因。双荧光素酶基因报告的检测结果图3B所示，miR-29a-3p明显抑制野生型AQP4(WT-AQP4)3′UTR报告基因的荧光素酶相对活性(P<0.05)，而对突变型AQP4(MUT-AQP4)3′UTR报告基因的荧光素酶相对活性无明显影响。转染miR-29a-3p较miR-NC组显著抑制AQP4蛋白水平，转染anti-miR-29a-3p较anti-miR-NC组显著提高AQP4蛋白水平(图3C，D)(P<0.05)。

2.4 miR-29a-3p过表达对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率和凋亡率的影响

与Aβ1-42+miR-NC组比较，Aβ1-42+miR-29a-3p组明显增加PC12细胞中miR-29a-3p表达量(图4A)，提升Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax蛋白表达量(图4D，E)，提高细胞存活率(图4B)，降低细胞凋亡率(图4C)，差异均具有显著性(P<0.05)。

2.5 抑制AQP4表达对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率和凋亡率的影响

与Aβ1-42+si-NC组比较，Aβ1-42+si-AQP4组明显降低AQP4和Bax蛋白表达量(图5A，B，E)，显著提高Bcl-2蛋白水平(图5A，E)，增加细胞存活率(图5C)，降低细胞凋亡率(图5D)，上述差异均达到显著水平(P<0.05)。

2.6 抑制miR-29a-3p表达逆转了甲基莲心碱(3μg/mL)对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率和凋亡率的影响

与Aβ1-42+Nef+anti-miR-NC组相比，Aβ1-42+Nef+anti-miR-29a-3p组明显降低miR-29a-3p表达量(图6B)，显著增加AQP4、Bax蛋白表达量(图6A，C，F)，减少细胞存活率(图6D)，增加细胞凋亡率(图6E)，差异均具有显著性(P<0.05)。

A.3′UTR of AQP4 contains nucleotide sequences that are complementary to miR-29a-3p; B.dual luciferase reporting experiment; C, D.miR-29a-3p regulates the expression of AQP4 protein;*P<0.05 compared with the miR-NC group;#P<0.05 compared with the anti-miR-NC group

图3 miR-29a-3p与AQP4靶向关系

A.relative expression level of miR-29a-3p; B.effect of miR-29a-3p over-expression on the survival rate of Aβ1-42-induced PC12 cells; C.effect of miR-29a-3p over-expression on apoptosis rate of Aβ1-42-induced PC12; D, E.effects of miR-29a-3p over-expression on the expression of apoptosis-related proteins in Aβ1-42-induced PC12 cells;*P<0.05 compared with Con group;#P<0.05 compared with Aβ1-42+ miR-NC group

图4 miR-29a-3p过表达对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率、凋亡率及其相关蛋白表达的影响

3 讨论

AD发病率随年龄的增长呈指数上升趋势，其病理特征主要表现为记忆、执行功能和认知能力的逐步下降，最终导致患者于3到10年内死亡[4]。2000年至2015年间，AD导致的死亡人数增加了123%[5]，被视为继肿瘤、心血管疾病和卒中之后的位于第4位致死疾病[6]，成为世界性的难题。因此，研究AD可能的发病机制，寻找有效的治疗药物，对于阿尔茨海默病具有十分重要的现实意义。Aβ蛋白是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解产生的肽段，其沉积与AD关系密切[7]。其中，Aβ1-42含42个氨基酸片段，广泛应用于AD模型研究[8]。本研究同样利用Aβ1-42建立体外AD模型，结果发现，Aβ1-42模型组细胞存活率、Bcl-2表达明显低于对照组，细胞凋亡率和Bax表达量显著高于对照组。

甲基莲心碱分子式为C38H44N2O6，属于生物碱类成分，在肺癌等诸多癌症中具有良好的应用价值[9]，也可作为治疗和预防阿尔茨海默病和其他氧化应激相关疾病的候选药物[10]。在常染色体显性遗传性神经退行性疾病亨廷顿病中，甲基莲心碱通过诱导自噬降低PC12细胞中突变的亨廷顿蛋白水平或α-突触核蛋白毒性，在以运动功能和认知能力丧失为特征的神经退行性疾病治疗方面表现出一定潜力[11]。甲基莲心碱通过增强慢性脑缺血诱导的大鼠海马CA1区Notch1信号通路,从而有效改善大鼠学习记忆功能障碍[12]。本研究中，不同剂量的甲基莲心碱处理后，Aβ1-42诱导的PC12细胞存活能力、Bcl-2蛋白水平显著高于模型组，细胞凋亡率、Bax蛋白水平则明显低于模型组，且与甲基莲心碱剂量呈一定的依赖性，说明甲基莲心碱对Aβ1-42诱导的PC12细胞具有保护作用，可以促进细胞存活并抑制细胞凋亡，与甲基莲心碱抗AD活性的报道[10]相符。

A.protein electrophoresis; B.relative expression level of AQP4 protein; C.effect of inhibition of AQP4 expression on the survival rate of Aβ1-42-induced PC12 cells; D.effect of inhibition of AQP4 expression on apoptosis rate of Aβ1-42-induced PC12 cells; E.effect of inhibition of AQP4 expression on apoptosis related protein expression in Aβ1-42-induced PC12 cells;*P<0.05 compared with Con group;#P<0.05 compared with Aβ1-42+ si-NC group

图5 抑制AQP4表达对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率、凋亡率及其相关蛋白表达的影响

微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一种内高度保守的非编码RNA，与靶基因发生特异性结合，从而调控基因表达，影响多种疾病进程，包括阿尔茨海默病[13]。AQP4基因与阿尔茨海默病密切相关，AD模型中，miR-29a表达下调[14]，AQP4 mRNA和蛋白表达上调[15]，与本实验中结果相同。不同浓度的甲基莲心碱干预后，miR-29a-3p表达上调，AQP4 mRNA和蛋白表达下调。生物学信息预测和双荧光素酶基因报告实验验证了miR-29a-3p与AQP4的靶向关系。上调或下调miR-29a-3p表达显著调控AQP4蛋白水平。另外，miR-29a-3p过表达显著提高Aβ1-42诱导的PC12细胞存活率和Bcl-2蛋白表达量，降低细胞凋亡和Bax蛋白表达，与抑制AQP4表达作用相同。上述结果表明miR-29a-3p和AQP4参与Aβ1-42诱导的PC12细胞存活和凋亡等生物学过程，且miR-29a-3p可以靶向负性调控AQP4表达。

为了进一步观察miR-29a-3p和AQP4是否为甲基莲心碱影响Aβ1-42诱导的PC12细胞存活和凋亡的相关因子，在高剂量甲基莲心碱组细胞转染anti-miR-29a-3p，结果发现抑制miR-29a-3p表达逆转了甲基莲心碱对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活和Bcl-2蛋白表达的促进作用，以及逆转了其对细胞凋亡和Bax蛋白水平的抑制作用。此外抑制miR-29a-3p表达还逆转了甲基莲心碱处理Aβ1-42损伤PC12细胞后的miR-29a-3p和AQP4蛋白表达。由此得出，甲基莲心碱抑制Aβ1-42致PC12细胞损伤与miR-29a-3p和AQP4相关。综上所述，甲基莲心碱能够抑制Aβ1-42所致的PC12细胞损伤，促进细胞存活并抑制细胞凋亡，其作用机制与调控miR-29a-3p/AQP4表达有关。

A.protein electrophoresis; B.relative expression level of miR-29a-3p; C.relative expression level of AQP4 protein;D.inhibition of miR-29a-3p reversed the effect of neferine on the survival rate of Aβ1-42-induced PC12 cells; E.inhibiting the expression of miR-29a-3p reversed the effect of neferine on the apoptosis rate of Aβ1-42-induced PC12 cells; F.inhibiting the expression of miR-29a-3p reversed the effect of neferine on the expression of apoptosis related proteins in Aβ1-42-induced PC12 cells;*P<0.05 compared with Aβ1-42 group;#P<0.05 compared with Aβ1-42+Nef+ anti-miR-NC group

图6 抑制miR-29a-3p表达逆转了甲基莲心碱(3 μg/mL)对Aβ1-42诱导的PC12细胞存活、凋亡及其相关蛋白表达的影响