miR-29a对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响

郭雄飞，王 挺，汤立新

(河南省南阳市中心医院 郑州大学附属南阳医院 骨科, 河南 南阳 473000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜炎为主要特点的系统性慢性自身免疫性疾病，致残率高[1]。RA发病机制复杂，涉及滑膜细胞、T细胞、软骨细胞、巨噬细胞等，其中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)是临床上RA反复发作、久治不愈和预后不良的一个主要原因，已被认为是一类“类肿瘤样”细胞[2]。因此，研究FLS已成为RA治疗的重点。microRNA(miRNA)是一类在进化上保守的长度约18～22 nt的非编码RNA，在真核生物中普遍存在，可通过与靶mRNA的3′UTR结合，通过降低靶mRNA后抑制其转录后翻译，调节蛋白生成，从而发挥效应。已有多项研究表明，miRNA与自身免疫性疾病如RA密切相关[3]。miR-29a是miRNA大家族成员之一，有研究表明，RA中miR-29a下调表达，过表达miR-29a可通过靶向STAT3抑制FLS增殖和诱导凋亡，但其作用机制研究的尚未明确[4]。活化T细胞核因子5(nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5)是广泛存在的一个与渗透压有关的转录因子，有研究表明，RA滑膜中NFAT5高表达，抑制NFAT5表达可降低RA滑膜增殖和血管生成[5]；巨噬细胞NFAT5表达可促进慢性关节炎的发生[6]。miR-29a是否可调节NFAT5影响FLS增殖和凋亡尚未清楚。因此，本研究旨在探讨miR-29a是否可靶向抑制NFAT5影响FLS增殖和凋亡，并进一步研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本：RA滑膜组织取自湖北省荆州市中心医院关节外科进行膝关节置换手术的RA患者。健康人滑膜组织取自因外伤行关节手术的患者。所有样本的采集经过患者的知情同意，并签订知情同意书及通过医院伦理委员会批准(19NYZX025)。RA患者的临床诊断均符合美国风湿病协会修订的RA分类标准。

1.1.2 试剂及试剂盒：DMEM培养基和FBS(Gibco公司)；MTT和DMSO(Sigma-Aldrich公司)；miR-29a mimics、anti-miR-29a、si-NFAT5、对照片段(广州锐博技术有限公司)；RT-qPCR试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、T4 DNA连接酶和限制性内切酶(TaKaRa公司)；NFAT5、p38、p-p38和cleaved-caspase3抗体(CST公司)；细胞凋亡试剂盒(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 FLS的原代分离培养：无菌条件下取滑膜组织，PBS浸泡及冲洗后，用眼科剪将滑膜附属的多余外周组织除去，并将组织剪成小块(2 mm×2 mm×2 mm)，PBS再次冲洗，将组织块移至细胞培养瓶中，细胞培养瓶底部朝上，于5%体积分数CO2、37 ℃恒温培养箱中培养30 min，在培养瓶中加入3 mL含10% FBS的DMEM高糖培养基，于培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞增殖情况，细胞汇合度达90%时，将组织小块转移至细胞培养瓶中继续培养。对留在培养瓶中的细胞，根据实验需要进行传代。健康人化膜组织来源的FLS标记为n-FLS,RA患者来源的FLS标记为RA-FLS。实验所用细胞为3代～6代。

1.2.2 Western blot检测蛋白表达：适量蛋白裂解液提取n-FLS和RA-FLS总蛋白。BCA法检测蛋白浓度。按照50 μg蛋白样品与上样缓冲液4∶1比例混匀，于100 ℃沸水中变性5 min。配置5%浓缩胶和12%分离胶，经SDS-PAGE分离、电转移至PVDF膜后，将膜置于5%蛋白封闭液中1 h，TBST洗膜，加稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加稀释好的HRP标记的二抗(稀释比例1∶3 000)，于37 ℃摇床振荡封闭1 h，洗膜，将ECL显色液滴加到PVDF膜上，在暗盒中使用X线胶片曝光。拍照。Quantity One软件进行灰度值分析。以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.2.3 细胞转染；以5×104个/孔接种3代～6代的RA-FLSs于12孔板，于5%体积分数CO2、37 ℃恒温培养箱中孵育16～24 h，当细胞达70%～80%融汇度时，参照LipofectamineTM2000说明书进行转染。分别制备miR-NC、miR-29a mimics(简称miR-29a)、anti-NC、anti-miR-29a、si-NC、si-NFAT5及miR-29a+pcDNA5-NFAT5与LipofectamineTM2000复合物，将复合物加入6孔板相应孔内，继续培养48 h用于后续实验。

1.2.4 RT-qPCR检测基因表达：收集RA-FLSs，加适量的Trizol裂解，提取细胞总RNA，用紫外分光光度计对RNA质量进行检测。取300 ng总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。根据引物设计原则，用Premier5.0软件设计miR-29a及NFAT5引物，送由上海吉玛生物公司合成。以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，根据PCR试剂盒说明制备反应体系及设置反应条件。通过美国Thermo荧光定量PCR仪进行扩增。每孔设置6个复孔。以所得Ct均值，通过2-△△Ct公式计算miR-29a和NFAT5 mRNA相对表达量。实验重复3次。

1.2.5 双荧光素酶报告实验：根据Targetscan等靶基因预测软件发现miR-29a与NFAT5的 3′UTR存在结合位点。根据NFAT5基因的3′UTR区序列设计并合成PCR引物。用T4 DNA连接酶将miR-29a全长片段与pcDNA5空载体连接，NFAT5全长片段与pcDNA5载体连接。然后将连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，扩增后抽提质粒DNA、酶切及测序验证。将预测的与成熟miR-29a mRNA 结合的NFAT5 mRNA 3′UTR区域野生型(WT)及突变型(MUT)的特定序列插入到pGL3-Promoter-Vector载 体 里，构建出pGL3-NFAT5 3′UTR-WT 和pGL3-NFAT5 3′UTR-MUT 2个质粒，并用LipofectamineTM2000试剂将其转至RA-FLSs。按照双荧光素酶检测试剂盒说明进行检测荧光素酶活性。各组细胞的相关荧光强度=萤火虫荧光强度/海肾荧光强度。实验重复3次。

1.2.6 细胞活力检测：取对数增殖期的RA-FLSs接种于96孔板，每孔200μL(约2×104个细胞)，加miR-29a mimics、si-NFAT5及miR-29a+NFAT5，培养48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，于培养箱中继续孵育4 h，弃掉上清，每孔中加150 μL的DMSO，摇床上低速振荡10 min，以使结晶能够溶解充分。酶标仪测定490 nm波长测定吸光度值(A值)。每孔设置5个复孔，实验重复3次。

1.2.7 细胞凋亡检测 miR-29a mimics、si-NFAT5及miR-29a+NFAT5转染RA-FLSs 48 h后，收集细胞。按照annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒说明检测细胞凋亡。具体操作如下：预冷PBS洗涤细胞，加1 mL 1×annexin V-FITC结合缓冲液，离心，去上清，再加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，再分别加入10 μL annexin V-FITC及5 μL PI，轻柔混匀，室温避光孵育30 min，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 FLS标志物检测

与n-FLS比较，RA-FLSs中CHI3L1表达明显升高(P<0.05)(图1)。

2.2 过表达miR-29a对RA-FLS活力和凋亡影响

miR-29a mimics转染RA-FLSs后，细胞中miR-29a mRNA表达明显升高，细胞活力明显降低，凋亡率明显升高(P<0.05)(图2)。

2.3 抑制NFAT5对RA-FLS活力和凋亡影响

NFAT5的特异性siRNA转染RA-FLSs后，NFAT5 mRNA表达明显降低，细胞活力明显降低，凋亡率明显升高(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with n-FLS

A.relative expression of miR-29a mRNA after miR-29a mimics were transfected into RA-FLS; B.RA-FLS activity after miR-29a over-expression; C,D.apoptosis rate of RA-FLS after miR-29a over-expression;*P<0.05 compared with blank group

图2 过表达miR-29a对RA-FLS活力和凋亡影响

2.4 过表达miR-29a或抑制NFAT5对RA-FLS中p38MAPK信号通路影响

与空白组相比，过表达miR-29a或抑制NFAT5均可下调p-p38表达，上调cleaved-caspase3表达(P<0.05)(图4)。

2.5 双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a靶基因

RA-FLS中 miR-29a与野生型NFAT5 3′UTR共转染组荧光素酶活性明显降低，而anti-miR-29a与野生型NFAT5 3′UTR共转染组荧光素酶活性明显升高(P<0.05)。过表达miR-29a可明显下调NFAT5表达，抑制miR-29a表达可明显上调NFAT5表达(P<0.05)(图5)。

2.6 miR-29a靶向NFAT5对RA-FLS活力和凋亡影响

过表达miR-29a可明显抑制RA-FLS活力，诱导RA-FLS凋亡，而过表达NFAT5可减弱过表达miR-29a对RA-FLS活力和凋亡的影响(P<0.05)(图6)。

A.relative expression level of NFAT5 mRNA after si-NFAT5 was transfected into RA-FLSs; B.RA-FLS activity after inhibition of NFAT5 expression; C，D.apoptosis rate of RA-FLS after inhibition of NFAT5 expression；*P<0.05 compared with blank group

图3 抑制NFAT5对RA-FLS活力和凋亡影响

A.protein expression bands; B.relative expression levels of p38, p-p38 and cleaved-caspase3 proteins;*P<0.05 compared with blank group

图4 过表达miR-29a或抑制NFAT5对RA-FLS中p38MAPK信号通路的影响

3 讨论

近年来，由于关节炎治疗技术的提升，RA患者预后有了明显的改善，多数患者病情得到较好的控制，但仍有部分患者治疗效果不佳[7]。RA关节破坏的主要原因是关节滑膜过度增殖，因此，阐明RA滑膜细胞生物学特性及影响机制对于RA治疗具有重要意义。miRNA是一类非编码的小分子RNA，广泛参与各种生理病理过程的调控，在RA发病过程中也发挥重要作用[8]。研究显示，敲除miR-29a可引起骨关节炎患者FLS中III型胶原、TGF-β1、MMP9和ADAMTS5的高表达，此外，miR-29a靶向VEGF降低骨关节炎患者滑膜的血管生成[9]；过表达miR-29a可靶向STAT3抑制骨关节炎患者FLS增殖，并诱导其凋亡[4]。本研究检测了健康人FLS(n-FLS)和RA患者FLS(RA-FLS)中标志蛋白CHI3L1的表达，结果显示，RA-FLS中CHI3L1蛋白表达明显增加，提示RA患者滑膜组织块分离得到了FLS。过表达miR-29a明显抑制了RA-FLS活力，并诱导其凋亡，与既往研究结果一致，表明miR-29a参与调控RA-FLS增殖和凋亡。

A.targeting relationship between miR-29a and NFAT5 were detected by dual luciferase report assay; B,C.the expression of NFAT5 protein after over-expression of miR-29a or inhibition of NFAT5;*P<0.05 compared with miR-NC group;#P<0.05 compared with anti-NC group

图5 miR-29a和NFAT5的靶向关系验证

A.RA-FLSs activity after simultaneous over-expression of microRNAs-29a and NFAT5; B, C.RA-FLSs apoptosis rates after simultaneous over-expression of miR-29a and NFAT5;*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with miR-29a group

图6 miR-29a靶向NFAT5对RA-FLS活力和凋亡影响

NFAT5是一个与渗透压有关的转录因子，生物学功能广泛[10]。有研究显示，RA滑膜中NFAT5高表达，抑制NFAT5表达可降低RA滑膜增殖和血管生成[7]。本研究显示，抑制NFAT5表达可明显降低RA-FLS活力，诱导细胞凋亡。双荧光报告基因检测系统检测及过表达或抑制miR-29a后NFAT5表达后发现NFAT5是miR-29a的靶基因。过表达NFAT5可减弱过表达miR-29a对RA-FLS活力抑制和凋亡促进作用。提示miR-29a可靶向NFAT5影响RA-FLS活力和凋亡。

p38MAPK是细胞内一条重要的信号途径，在炎性反应、肿瘤发生、骨关节炎等多种生理病理过程中发挥关键作用[11]。有报道显示，骨关节炎软骨中p38磷酸化含量明显高于健康人群，p38抑制剂可明显降低软骨疼痛及退变[12]。抑制p38MAPK信号通路可明显降低RA-FLS活力和诱导凋亡[13]。说明p38MAPK信号通路与关节炎的发生和发展密切相关。Caspase3是p38MAPK信号通路下游调控基因，其活化可促进细胞凋亡。研究显示，RA中cleaved-caspase3表达明显降低[14]。本研究结果显示，过表达miR-29a或抑制NFAT5表达均可明显下调磷酸化的p38表达，上调cleaved-caspase3表达，提示miR-29a可通过靶向NFAT5抑制p38MAPK信号通路影响RA-FLS活力和凋亡。

综上所述，miR-29a可通过靶向调控NFAT5下调p38MAPK信号通路抑制RA-FLS活力，并诱导其凋亡，可能是RA诊疗的潜在作用靶点。