基于RNA-seq的db/db小鼠大脑皮质的转录组学分析

郭宝璐，白 涛，郭 杰，刘萌萌，杨彩红，章 毅，范彦英

(山西医科大学 基础医学院 药理教研室，山西 太原 030001)

长期的血糖升高或胰岛素抵抗不仅会对外周组织产生影响，而且还可导致中枢神经系统损伤。有大量报道称糖尿病会造成认知能力下降，加速帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发展进程，引起焦虑和抑郁[1-3]。尽管已有研究表明晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的合成增加，氧化应激及线粒体功能障碍等参与了糖尿病诱导的脑功能障碍[4-6]，但其分子发病机制目前尚不清楚。

高通量筛选技术使许多疾病的新分子靶点和功能通路被发现。然而，目前关于糖尿病模型中脑组织转录组学变化的研究尚缺乏。db/db小鼠是一种4号染色体的leptin受体基因缺陷导致的自发性2型糖尿病小鼠，本研究拟利用该小鼠大脑皮质样本进行全转录组测序(RNA-sequencing，RNA-seq)，以探索参与调节2型糖尿病诱导的脑功能障碍的潜在差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)及新的通路和网络。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和样本；SPF级雄性C57BL/6 野生型(WT)，体质量(20.1±0.5)g和db/db小鼠(diabetes mouse)，体质量(37.7±1.7)g，每组9只[北京维通利华公司，许可证号：SCXK(京)2016-0010]。所有动物实验均遵照国家实验动物饲养与使用指南，饲养温度(22±1)℃，12 h明暗循环，自由饮食和饮水。在第8和24周进行血糖和体质量检测。

于第24周处死动物并收集大脑皮质用于RNA-seq实验。每3个皮层合并为1个样本，每组3个样本。液氮冷冻状态下研磨并提取总RNA，并储存在-80 ℃直至测序。

1.1.2 试剂：Trizol和M-MuLV Reverse Transcriptase(上海生工生物工程有限公司)，Qubit 2.0 RNA检测试剂盒和 Qubit 2.0 DNA检测试剂盒(上海斯信生物科技有限公司), T4 RNA Ligase 1和 T4 RNA Ligase 2(美国纽英伦生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 转录组测序：利用SOLID全转录组分析试剂盒构建文库，按说明书进行操作。

1.2.2 DEGs的表达分析：通过BioMart(http://www.biomart.org/biomart/martview)从Ensembl数据库中检索注释信息。采用 transcripts per million (TRM)进行表达水平评估。使用R语言Oligo包对表达值进行背景校正，Limma包对DEG进行鉴定。筛选标准为：1)log2FC>1或<-1；2)q值<0.05；3)TPM>5，满足三项标准的基因视为DEG。

1.2.3 功能和通路富集分析及蛋白互作网络分析：基于筛选出的DEGs，利用STRING数据库(http://string-db.org/)进行GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析(阈值：FDR value<0.05，且至少包含两个基因)。同时，筛选蛋白-蛋白互作(the protein-protein interaction，PPI)网络(阈值：Combined score>0.4)，用Cytoscape生成基于DEG的PPI网络。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 db/db与WT小鼠血糖与体质量的变化

与WT组相比，第8和24周时小鼠体质量和血糖均显著增高(表1)。

2.2 DEGs分析结果

与WT组相比，db/db组的大脑皮质发生变化的306个转录本中有178个表达上调，128个表达下调(图1)；同时，DEGs中，43个基因上调，59基因下调(图2)，具体的DEGs(表2,3)。此外，还发现与细胞凋亡和神经功能紊乱相关的一些重要基因的表达也发生了改变，如Trim17、Arih1及Nectin3。

表1 db/db与WT小鼠在8和24周龄的体质量与血糖

*P<0.01,**P<0.001 compared with WT group.

Expression level was presented as log2 (TPM+1)

2.3 PPI网络分析结果

从筛选出的102个DEGs中，利用STRING平台构建了PPI网络图(图3)。其中连接节点数大于10的13个枢纽基因被确定，包括mt-Dd1、mt-ND2、mt-ND3、mt-ND4、mt-ND4l、mt-Dd5、mt-ND6、mt-Co1、mt-Co2、mt-Co3，mt-Cytb，mt-ATP8和Uqcrb。以上13个枢纽基因均表达下调，且大多属于线粒体编码家族。

2.4 GO和KEGG分析结果

排名前20的GO功能富集(图4)。与WT组相比，db/db小鼠的大脑皮质显示出了多种富集，如生物过程类别中的细胞过程功能，细胞组分类别中的细胞部分功能及分子功能类别中的结合功能。同时，KEGG富集结果显示这些靶基因在代谢、PD、AD等通路中高度富集(表4)，且这些富集通路中的DEGs主要影响了线粒体氧化磷酸化过程。

图2 102个DEGs的火山图

3 讨论

本研究首次对db/db小鼠大脑皮质样本进行了全转录组学分析。基于筛选出的DEGs，发现了许多显著变化的GO功能和KEGG通路富集。同时，发现被影响到的PPI网络主要与线粒体功能障碍有关。该研究进一步证实了2型糖尿病的发展会促进中枢神经系统损伤。

在升高的DEGs中，Clcnka位居第一，它编码电压门控性氯离子通道，目前该基因在脑科学和糖尿病领域还未受到关注。其在心衰、高血压及肾功能状态中扮演着重要角色[7-9]。本研究首次指出Clcnka的表达在中枢神经系统中会被2型糖尿病所影响。Trim17是另一种上调的DEG，它的表达产物是一种E3泛素连接酶，其与糖尿病的关系尚未见报道。研究发现，Trim17可通过抑制Trim41引起ZSCAN21的降解，进而增加ɑ-synuclein的堆积，而ɑ-synuclein与PD的发病机制密切相关[10]。因此，脑内Trim17表达上调可能是糖尿病引发PD的主要原因之一，其可能是2型糖尿病患者预防PD的潜在干预靶点。

表2 db/db小鼠大脑皮质表达上调基因

表3 db/db小鼠大脑皮质表达下调基因

图3 PPI网络分析图

下调的DEGs主要与线粒体编码和氧化还原呼吸链有关，包括mt-Nd家族、mt-Co1-3、mt-Cytb、mt-ATP8及Uqcrb。本研究首次发现2型糖尿病模型脑组织中这些基因的mRNA表达显著下调，且KEGG分析结果也显示这些线粒体相关的DEGs在PD，AD 等通路中被富集。因此，这些基因的显著变化可能参与糖尿病所导致的脑损伤。此外，本研究所构建的PPI网络也主要涉及以上基因，这些结果加深了人们对糖尿病、神经退行性疾病和脑内线粒体功能障碍之间相互作用关系的理解。

图4 GO功能注释和富集分析

表4 DEGs的KEGG富集分析

Arih1也是一个显著下调的DEG，它的表达产物是一种E3泛素连接酶。Arih1不仅可调控胰岛素分泌[11]，而且还可能对神经退行性疾病中的神经元产生保护作用[12]，提示减少的Arih1表达可能是加重2型糖尿病脑损伤的另一原因。Nectin-3是另一个新发现的与糖尿病相关的基因，它的表达产物是一种突触细胞黏附分子。Nectin-3表达减少会导致空间记忆障碍、树突棘缺失及突触传递功能受损[13-14]。据此，Arih1和nectin-3可能是预防2型糖尿病引起神经退行性疾病的潜在治疗靶点。

综上所述，本研究使用RNA-seq技术比较了db/db和WT小鼠大脑皮质转录组差异，发现了多种新的相关基因、富集及网络。这进一步揭示了2型糖尿病与中枢神经系统疾病之间的关系及可能分子机制。