人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达和纯化

陈风晔，刘孟雨，周雅博，梁晓雨，黄 波，解 静

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室 免疫学系，北京 100005)

穿孔素(perforin,PRF)是存在于细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)和天然杀伤细胞(naturalkillercell, NK)胞质毒颗粒中的糖蛋白，由550个氨基酸组成，分子量为67 ku。穿孔素为单链结构，N端以亲水性氨基酸为主，C端则以疏水性为主，穿孔素单体分子被释放后，在Ca2+存在下活化形成10个以上单体分子组成的管状结构多聚体，通过其疏水C末端插入细胞膜发挥作用[1]。CTLs和NK细胞可通过穿孔素—颗粒酶途径来防御病毒感染或异常细胞侵袭[2-4]。CTLs与靶细胞膜表面抗原接触，穿孔素被激活后在靶细胞上形成跨膜孔洞，颗粒酶进入细胞，活化caspase级联反应，导致靶细胞凋亡[1,5-6]。目前商品化的穿孔素基本上都是使用酵母表达系统表达的蛋白，并不具备细胞打孔活性，难以获得大量高活性的穿孔素，现有的穿孔素相关研究受到很大的局限。因此优化穿孔素的纯化方法具有重大意义。故本文旨在用一种简单方法在昆虫细胞中表达并纯化出有活性的人穿孔素，为相关研究的推进提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和细胞系：人乳腺癌细胞系MCF-7(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；昆虫草地贪夜蛾细胞sf9(spodoptera frugiperda cell 9)和pFastBac1载体(Thermo Fisher公司)。

1.1.2 试剂：DNA酶、PrimeSTARHS DNA Polymerase with GC Buffer、5× In-Fusion HD Enzyme Premix和电泳缓冲液(TaKaRa公司)；快速内切酶EcoRⅠ、CellfectinTMⅡ Reagent、快速内切酶XbaⅠ、Grace’s Insect Medium和碘化丙啶(Thermo Fisher公司)；Agrose(Invitrogen公司)；杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒、考马斯亮蓝超快染色液、亲和层析柱空柱管(12 mL)、和快速银染试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；琼脂、酵母提取物、蛋白胨和氯化钠(Sigma-Aldrich公司)；无内毒素质粒大提试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒和普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；PRF cDNA ORF Clone和SIM SF培养基(Sino Biological公司)；Ni-NTA Agarose(Qiagen公司)；蛋白质电泳缓冲液(北京全式金生物技术有限公司)；Anti-His抗体(CST公司)

1.2 方法

1.2.1 pFastBac1-PRF-6×His重组质粒的构建：对pFastBac1载体采用快速内切酶EcoRⅠ，XbaⅠ进行酶切(37 ℃，30 min)，凝胶电泳后回收4 700 bp的线性化载体；采用PRF引物对人PRF的cDNA进行PCR扩增，PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性98 ℃ 10 s，退火60 ℃ 5 s，延伸72 ℃ 2 min，变性、退火和延伸重复30个循环，将目的片段进行胶回收。测量A260/280值后，使用5× In-Fusion HD Enzyme Premix将上述片段在PCR仪中与pFastBac1载体进行连接反应(50 ℃，15 min)。随后将连接产物pFastBac1-PRF转化入Stbl3感受态细胞，在含1%氨苄青霉素ampicillin(1 000 g/L)的固体LB培养基上涂板，37 ℃过夜培养。第2天挑取单克隆扩增后提取质粒并使用PRF(sequencing)引物测序，将测序结果与人穿孔素序列进行比对。

表1 普通PCR扩增引物序列和测序引物序列

1.2.2 pFastBac1-PRF-6×His的转化及杆状病毒质粒bacmid的提取：经过测序比对后，将50 ng成功构建的质粒pFastBac1-PRF-6×His转化入含有杆状病毒质粒bacmid的DH10α-Bac感受态细胞中，加入500 μL无菌SOC培养基后，置于摇床培养4 h(37 ℃，200 r/min)。制备含50 μg/mL卡那霉素(kanamycin)，7 μg/mL庆大霉素(gentamycin)，10 μg/mL四环素(tetracycline)，100 μg/mL X-gal，40 μg/mL IPTG的固体LB培养基，而后取出50 μL菌液涂板，37 ℃培养72 h后筛选出阳性白斑菌落。挑取阳性白色菌落和阴性蓝色菌落进行扩增，提取DH10α-Bac中构建成功的bacmid-PRF-6×His质粒和构建失败的bacmid质粒。

1.2.3 PCR验证bacmid-PRF-6×His序列：使用杆状病毒质粒bacmid引物对杆状病毒质粒bacmid-PRF-6×His进行PCR扩增(预变性95 ℃ 5 min; 98 ℃ 10s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 min，30个循环)，扩增产物进行凝胶电泳鉴定。

1.2.4 杆状病毒(Baculovirus)的制备和扩增：提前将5×105个sf9昆虫细胞接种到6 cm2的细胞培养皿中，27 ℃培养1 h待细胞贴壁。准备两个1.5 mL的离心管，各加入100 μL Grace培养基，其中一个加入1 μg bacmid-PRF-6×His质粒，另外一个加入6 μL转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent，将两者轻柔混匀后静置30 min，加入800 μL Grace培养基轻柔混匀后缓慢滴入接种了sf9的6cm2细胞培养皿中，放置于27 ℃培养。5 h后更换培养基为SIM SF 培养基，继续27 ℃培养72 h。72 h后将培养基室温500×g离心5 min后上清液即为杆状病毒P1。将200 μL P1病毒加到接种了4×106个sf9细胞的T 25 cm2的细胞培养瓶中，置于27 ℃培养72 h后，将培养基室温500×g离心5 min后获取的上清液为杆状病毒P2。将300 μL杆状病毒P2加到接种了1×107个sf9细胞的T 75 cm2的细胞培养瓶中，置于27 ℃培养72 h，将培养基室温500×g离心5 min后获得的上清液为杆状病毒P3。

1.2.5 穿孔素在sf9中的表达：将1×107个sf9细胞接种到含10 mL 昆虫SIM SF培养基T 75 cm2细胞培养瓶中，27 ℃培养1 h待细胞贴壁，然后加入人穿孔素杆状病毒P3 600 μL，27 ℃培养72 h，观察到细胞核变大，细胞变圆。收集细胞，每个T 75 cm2培养瓶的细胞沉淀加入1 mL非变性细胞裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH=8.0)，4 ℃充分裂解细胞后，4 ℃ 15 000×g离心15 min获取上清。留取50 μL记作CL(celllysate)，剩余液体加入50 μL Ni-NTA agarose，在旋转摇床上旋转2 h(4 ℃,30 r/min)。将与蛋白充分结合的agarose装填在亲和层析柱空柱管中，在4 ℃条件下利用重力作用把目的蛋白从His柱上洗涤和洗脱。首先收集装填过程中的穿流液，记为FT(flow through)。后采用非变性洗涤液洗涤3次(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol咪唑，pH=8.0)，收集每次洗涤的穿流液，记作Wash1-Wash3。再采用不同浓度非变性洗涤液进行梯度洗脱共4次(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，4次洗脱的咪唑浓度分别为20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L，pH=8.0)，收集每次洗脱的穿流液，记作Elution 1-Elution 4[7]。

1.2.6 Western blot检测和考马斯亮蓝染色鉴定：各取20 μL上述液体进行SDS-PAGE胶电泳后，将凝胶取出加入适量快速考马斯亮蓝染色液室温20 r/min染色30 min后，加入适量去离子水室温20 r/min洗涤30 min，共3次，再加入适量去离子水后置于4 ℃ 20 r/min洗涤过夜，第2天将胶取出拍照，选取在67 ku有单一条带的样本进行下一步实验。

1.2.7 人穿孔素的浓缩和定量：将上一步选取的洗脱液加入分子量为30 ku的15 mL超滤管中，4 ℃ 12 000×g离心30 min进行浓缩，随后取1 μL蛋白与0.1、0.5、1、2 μg牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作对照进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据快速银染试剂盒说明书，对凝胶进行染色，脱色后拍照。采用ImageJ软件对其银染图进行吸光度值分析得到其浓度并计算表达量。

1.2.8 人穿孔素的His标签的检测：取1 μL纯化浓缩后的表达产物采用Anti-His 抗体进行Westernblot检测重组人穿孔素是否表达。

1.2.9 人穿孔素的活性检测：将1×105的MCF-7制成100 μL单细胞悬液并置于1.5 mL 离心管中，加入终浓度为2 mmol/L的CaCl2，并分别在离心管中加入0、50、100、200和500 ng的人穿孔素，37 ℃孵育30 min，加入终浓度为100 μmol/L的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，室温避光放置5 min，使用C6流式细胞仪检测单个细胞中PE通道荧光强度，结果使用BD Accuri C6 Software、FlowJo以及GraphPad分析，统计PI染色阳性的细胞比例[8]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 bacmid-PRF1-6×His的构建

对PRF序列进行PCR扩增后，所需目的产物为1 700 bp，获得4个目的片段(图1)。经连接、转化、蓝白斑筛选后，阴性对照蓝斑菌落提取的空载bacmid载体的PCR产物在300 bp，白斑菌落提取的正确转化的重组杆状病毒质粒bacmid-PRF1-6×His在4 000 bp，由结果可见bacmid-PRF1-6×His构建成功(图2)。

L1.marker, L2-L5.PRF repeating amplification productsunder the same reaction conditions

L1.marker; L2.PCR products of bacmid; L3.PCR products of bacmid-PRF1-6×His

2.2 重组人穿孔素的纯化及鉴定

经杆状病毒P3感染后的sf9细胞裂解液中表达大量人穿孔素，经过洗涤和洗脱后，在Elution 2-Elution 4获得67 ku的单条带蛋白，其最佳洗脱条件为：50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，30 mmol/L咪唑，pH=8.0(图3A)。将不同量牛血清白蛋白BSA(0.1、0.5、1和2 μg)和1 μL纯化的人穿孔素的银染结果进行灰度分析，从被杆状病毒P3感染的4×108个sf9细胞中得到纯化产物总量为763.4 μg(图3B)。使用Anti-His抗体对纯化产物进行Western blot检测，纯化产物中有穿孔素，条带比较弥散(图3C)。

2.3 重组人穿孔素的活性鉴定

在2 mmol/L CaCl2在的情况下，穿孔素可以在细胞膜表面打孔[2]，PI染料进入细胞内，细胞表现为PI染色阳性。由结果可见：将0 ng穿孔素组作为对照，随着穿孔素剂量的增加，靶细胞的PI阳性比例上升，说明纯化的人穿孔素可以在一定Ca2+离子浓度下使细胞膜排阻能力下降，可能对靶细胞膜进行了打孔，并呈现浓度依赖性，具有生物学活性(图4)。

3 讨论

穿孔素—颗粒酶途径一直以来都是免疫研究和肿瘤免疫研究中的热点，肿瘤免疫治疗更是最近新兴临床治疗的代表[9-10]。传统的穿孔素分离纯化方法是通过PRF高表达的人NK细胞系YT-Indy或者全血活化的T细胞来表达穿孔素，再使用固定化金属亲和色谱法或者差速离心方法进行分离纯化[11-12]。受限于蛋白纯化仪器AKTA等设备，国内的研究者对相关肿瘤免疫的研究因缺少相关蛋白而不得不停滞。

A.purified product of human perforin protein, Coomassie brilliant blue staining; B.silver staining of the purified product of human perforin protein; C.Western blot analysis of human perforin protein using anti-His antibody

图3 人穿孔素的纯化以及定量和定性

Fig 3 Purification, quantify and characterization of human perforin

A.1×105MCF-7 cells were co-incubated with 2 mmol/L CaCl2and different doses of purified human perforin and then stained with propidium iodide，flow cytometry was used to obtain the PI staining results of MCF-7 cells with different doses of human perforin(red value was PI positive percentage); B.PI staining positive percentage of MCF-7 cells with the different dose treatment of purified human perforin;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 ng group

图4 人穿孔素的生物学活性鉴定

此外，人穿孔素这一类毒蛋白表达和纯化过程中工程细胞的毒性耐受能力值得关注。采用人胚胎肾来源的HEK293细胞系表达纯化人的毒蛋白，表达出的有活性的人毒蛋白会攻击HEK293细胞，造成目的蛋白产量的减少和活性减少。昆虫细胞有完善的加工、修饰系统，形成多亚基组装等功能，采用不同种属的昆虫细胞sf9来表达人源的毒蛋白，提高宿主细胞对毒蛋白的耐受性，使目的毒蛋白的产量得到保证，活性得以保存。一般来说，6×His标签是融合蛋白中最常用的标签，工艺成熟且其6个氨基酸大小基本不会影响融合蛋白的结构和功能。就本文而言，His标签没有影响纯化的人穿孔素的生物学活性，相关性质有待进一步实验的验证。在本文中，纯化出的穿孔素在预期大小67 ku附近，并且采用Anti-His抗体进行Western blot检测纯化产物时发现条带较为弥散，这些可能与蛋白的降解和穿孔素的糖基化水平相关。穿孔素是糖蛋白，而不同糖基化水平的糖蛋白在采用Western blot检测的时候会处于不同的位置，呈现一个弥散的条带。并且在昆虫表达系统中，蛋白常常伴随着糖基化是其一大特性，因此纯化产物中可能含有不同糖基化水平的穿孔素，导致了纯化的穿孔素大小与条带弥散的变化。而如何在昆虫表达系统中控制目的蛋白的糖基化和在蛋白纯化过程中如何防止蛋白被降解，还需要进一步的研究。本文采用的简易纯化蛋白方法，得到了大量具有活性的人穿孔素，虽然纯度有一定限制，但是使用本文更为经济、简易的方法完成复杂的蛋白纯化，可以让国内刚起步的研究者获得自己想要的纯化蛋白，得以完成相关研究。