靶向调控c-SKI的microRNA的筛选及验证

王 娟，李 鹏，吕忠英，张 颖，曹桂秋

(新疆医科大学第五附属医院 心血管内科，新疆 乌鲁木齐 830001)

microRNA(miRNA)属于非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的一种，参与转录后基因表达调控，是维持心脏正常功能必需的胞内介质[1-3]。miRNA调控方式大致可分为“一对多”及“多对一”两种情况，即一个miRNA可靶向调节多个靶基因，而同一个基因又可能受不同miRNAs的调控，最终形成一个复杂的调控网络。miRNAs在心血管疾病中有重要的调节功能[4-6]，甚至是心血管病治疗潜在新靶点[3]。原癌基因c-SKI(Cellular Sloan-Kettering Institute，c-SKI)具有生物多样性，既往研究主要集中在脏器肿瘤、脂质代谢及损伤愈合等方面[7]。近期研究表明c-SKI可以抑制心肌纤维化[8]，而miRNAs也参与心肌纤维化的调节，由此推测miRNA和c-SKI之间可能存在靶向调节关系。本研究通过生物信息学分析预测并结合文献报道，初步筛选出能够靶向结合c-SKI的目的miRNA—miR-155a-5p和miR-17a-5p，通过双萤光素酶报告基因系统验证miR-155a-5p和miR-17a-5p与c-SKI的靶向关系。最后在人心肌成纤维细胞系(HCFBs)中检测miR-155a-5p和miR-17a-5p对c-SKI的调节作用，为后续进一步了解c-SKI的功能及miRNA在心肌纤维化中的调控作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和DMEM培养基(HyClone公司)；Trizol试剂盒、RT-qPCR和反转录试剂(Roche公司)；转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。c-SKI的3′-UTR模板及相关引物、miR-155a-5p和miR-17-5p模拟物、抑制剂及相应对照序列(金斯瑞生物技术有限公司合成)；psiCHECK-2载体和双萤光素酶基因分析系统(Promega公司)；抗c-SKI抗体(Abcam公司)；抗GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司)；裂解缓冲液和BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime公司)。

1.1.2 细胞：人胚肾上皮细胞系(293T)(中国科学院细胞库)；人心肌成纤维细胞系(HCFBs)(中国武汉PriCells公司)。用10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，CO2培养箱内培养(37 ℃、5% CO2)，传代。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染：待HCFBs增殖至80%汇合状态时，再用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、传代。将细胞按2×104个/孔密度接种(24孔板)，增殖至60%～70%汇合状态时更换无血清培养基，按照Lipofectamine 2000说明书转染，于培养箱(37 ℃，5% CO2)中6～8 h后，换成含血清的培养基继续培养细胞48 h。后收集标本检测，各实验组设3个复孔，每组实验重复3次。

1.2.2 c-SKI-3′-UTR野生型和突变型载体的构建:通过生物信息学软件预测miR-155a-5p或miR-17a-5p与c-SKI的3′-UTR的结合位点，通过NCBI搜索相对应的序列信息，选择结合位点前后300 bp序列构建c-SKI 3′-UTR双荧光素酶报告质粒。以psiCHECK-2-c-SKI(wt)为基础，设计定点突变引物构建突变质粒psiCHECK-2-c-SKI(mut)。构建成功的质粒均经过DNA测序，序列正确的用于后续实验。

1.2.3 双荧光素酶检测：基因系统检测样品luciferase的活性。转染后48 h，吸去原来的培养基，用PBS清洗2次。将1×细胞裂解液100 μL加入，37 ℃，15 min。收集细胞裂解液，离心1 min。取20 μL细胞裂解液至新离心管，将100 μL LAR Ⅱ工作液加入，快速混匀，读值2 s。检测萤火虫荧光素酶(firefly luc)活性。完成上述实验后，向每个样品中加入100 μL Stop & Glo试剂，快速混匀，放入发光检测仪，读值2 s，检测海肾荧光素酶(renilla luc)活性，计算数据。

1.2.4 RT-qPCR：按说明书提取细胞总RNA或总mRNA，反转录为cDNA，后以cDNA为模板进行PCR扩增。加入SYBR Premix Ex Taq，进行实时定量PCR。反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；61 ℃ 30 s；72 ℃ 20 s。运行39～42个循环；95 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；95 ℃ 15 s；读取数值，用2-△△Ct法进行分析。以上各步骤中，反应体系以及试剂用量均严格按照说明书进行，引物序列见表1。

1.2.5 蛋白免疫印迹：收获细胞并用裂解缓冲液匀浆，用试剂盒测定蛋白质浓度。通过8%～10% SDS-PAGE分离蛋白质(30 μg)，转PVDF膜。使用抗c-SKI或GAPDH特异性一抗(1∶1 000)，用5%脱脂奶粉封闭。后将膜进一步与相应的辣根过氧化物酶的二抗(1∶5 000)一起温育2 h，TBST洗膜3次后显色，用化学发光成像分析系统扫描，Image软件分析测试结果。

表1 PCR 反应的引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 c-SKI目的miRNA的筛选

通过Targetscan、Tarbase、miRanda及miRWalk数据库工具，预测能够靶向结合c-SKI的3′-UTR的miRNA共44个，结合文献报道参与胞外基质合成与心肌纤维化相关的miRNA，筛选出15个候选miRNA：miR-7、miR-15b、miR-17a、miR-21、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-33a、miR-34a、miR-155a、miR-204和miR-449a。将15个候选miRNAs模拟物转染至HCFBs，48 h，RT-qPCR检测细胞中各候选miRNA表达均显著升高(P<0.01)(图1A)，提示转染有效。RT-qPCR检测各组细胞中c-SKI的表达(图1B)，miR-24对c-SKI无抑制作用，其余miRNA均可抑制c-SKI的表达(P<0.05)，其中，miR-155a-5p 和miR-17-5p抑制作用最为明显。因此，确定为进一步研究的目的miRNAs。

2.2 c-SKI-3′-UTR 双荧光素酶报告载体的构建

2.2.1 psiCHECKTM-2-wt(909-915)、psiCHECKTM-2-mut(909-915)报告质粒的鉴定：将构建成功的c-SKI-3′-UTR双荧光素酶报告载体psiCHECKTM-2-wt(909-915)和psiCHECKTM-2-mut(909-915)分别用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定。电泳检测结果(图2)显示，质粒均被切成2条明显的条带，其中大片段为载体DNA，小片段约300 bp为c-SKI-3′-UTR序列。

A.mRNA expression of candidate miRNAs in HCFBs by using qPCR；B.c-SKI mRNA expression in each group by using PCR；*P<0.05，**P<0.01 compared with the NC mimics group

图1 c-SKI目的miRNAs的筛选

A.c-SKI-3′-UTR wild type recombinant plasmid enzyme products; B.c-SKI-3′-UTR mutent recombinant plasmid enzyne products; 1.psiCHECKTM-2-wt(909-915)+Xho Ⅰ/Not Ⅰ；2.psiCHECKTM-2-mut(909-915)+Xho Ⅰ/Not Ⅰ；M.DNA marker

2.2.2 psiCHECKTM-2-wt(971-977)-SKI、psiCHE-CKTM-2-mut(971-977)-SKI报告质粒的鉴定：将成功构建的c-SKI-3′-UTR 双荧光素酶报告载体psiCHECKTM-2-wt(971-977)和psiCHECKTM-2-mut(971-977)分别用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，电泳检测结果(图3)显示，质粒均被切成两条明显的条带，其中大片段为载体DNA，小片段约300 bp为c-SKI-3′-UTR序列。

A.c-SKI-3′-UTR wild type recombinant plasmid enzyme products; B.c-SKI-3′-UTR mutent recombinant plasmid enzyne products; 1.psiCHECKTM-2-wt(971-977)+Xho Ⅰ/Not Ⅰ；2.psiCHECKTM-2-mut(971-977)+Xho Ⅰ/Not Ⅰ；M.DNA marker

2.3 miR-155a-5p与c-SKI的靶向关系验证

将成功构建的c-SKI-wt[psiCHECKTM-2-wt(909-915)]和c-SKI-mut[psiCHECKTM-2-mut(909-915)]报告质粒分别和miR-155a-5p mimics和miR-155a-5p inhibitor共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测显示，与NC组相比，c-SKI-wt组双萤光素酶活性显著下降(P<0.01)；而给予miR-155a-5p inhibitor处理后，c-SKI-wt组荧光活性明显增强(P<0.05)；而miR-155a-5p mimics和miR-155a-5p inhibitor处理对c-SKI-mut组荧光活性无明显影响(图4)。

A.binding sites of miR-155a-5p and c-SKI-wt and c-SKI-mut，B.results of dual-luciferase reporter gene assay；*P<0.05，**P<0.01 compared with NC group

2.4 miR-17a-5p与c-SKI的靶向关系验证

将构建的c-SKI-wt[psiCHECKTM-2-wt(971-977)]和c-SKI-mut[psiCHECKTM-2-mut(971-977)]报告质粒分别和miR-17a-5p mimics和miR-17a-5p inhibitor共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测显示，与NC组相比，c-SKI-wt组双萤光素酶活性显著下降(P<0.05)；而给予miR-17a-5p inhibitor处理后，c-SKI-wt组荧光活性明显增强(P<0.05)；miR-17a-5p mimics和miR-17a-5p inhibitor处理对c-SKI-mut组荧光活性无明显影响(图5)。

A.binding sites of miR-17a-5p and c-SKI-wt and c-SKI-mut；B.results of dual-luciferase reporter gene assay；*P<0.05 compared with NC group

2.5 Western blot检测人心肌成纤维细胞中c-SKI的表达

将miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics、inhibitor及对照分别转染至HCFBs，48 h。与NC-mimics组相比，miR-155a-5p和miR-17a-5p mimics组中c-SKI表达显著下调(P<0.01)；miR-155a-5p和miR-17a-5p inhibitor组中c-SKI的表达显著上调(P<0.01)(图6)。在HCFBs中miR-155a-5p和miR-17a-5p均能够抑制c-SKI蛋白的表达。

1.NC-mimics；2.miR-155a-5p mimics；3.miR-17a-5p mimics；4.NC inhibitor；5.miR-155a-5p inhibitor；6.miR-17a-5p inhibitor; *P<0.01 compared with NC group

3 讨论

本研究结果发现，miR-155a-5p和miR-17a-5p可以靶向结合c-SKI，在HCFBs中负性调控c-SKI的表达。以上研究结果提示，c-SKI可能是miR-155a-5p和miR-17a-5p的靶基因，可能通过与c-SKI 3′-UTR结合，在转录后水平负性调控其表达。

c-SKI最初从Sloan-Kettering禽类反转录病毒中发现，在人体各组织中均有表达；作为辅阻遏子，可以抑制TGF-β/Smad信号通路[7]，具有抗纤维化特性。miRNAs几乎参与了所有细胞内的信号通路。关键是可以直接与靶基因位点结合，降低靶基因的表达丰度。miR-155a-5p是一个多功能基因，被认为是促纤维化因子。在病毒性心肌炎急性期，检测发现心肌组织中miR-155表达显著上调[9]。糖尿病心肌病中下调miR-155a-5p的表达可以抑制心肌纤维化[10]，改善心肌重构和心功能。miR-17a-5p属于miR-17-92家族的一员，miR17a-5p也参与调节心肌纤维化和重构进程[11]。microRNA与c-SKI在平滑肌细胞增殖[12]、肿瘤[13]及伤口愈合[14]等方面均存在重要的靶向调节关系。然而，c-SKI与microRNA在心肌纤维化中作用报道较少。本研究采用生物信息学方法，即用miRNA相关在线软件进行靶基因的预测，初步筛选出15个候选miRNAs。通过RT-qPCR的方法，检测心肌成纤维细胞中候选miRNA及c-SKI的表达量，发现miR-155a-5p和miR-17a-5p对c-SKI的抑制作用最显著。后通过双荧光素酶报告系统对miR-155a-5p和miR-17a-5p对c-SKI基因的靶向关系进行验证，发现miR-155a-5p能够靶向结合于c-SKI 3′-UTR的909-915位点，而miR-17a-5p靶向结合于c-SKI 3′-UTR的971-977位点。进一步转染实验中发现，在培养的HCFBs中转染miR-155a-5p mimics和miR-17a-5p mimics，能够导致c-SKI表达的下降，反之转染miR-155a-5p inhibitor和miR-17a-5p inhibitor，能够上调c-SKI的表达，与双荧光素酶报告系统结果一致。

本研究为心肌纤维化相关研究提供了基础，但有很多局限，只筛选了靶向c-SKI-3′UTR的miRNA，没有筛选在基因编码区或5′UTR的miRNAs，只根据文献针对性的筛选了2个miRNAs，实验欠全面，在后续的实验中将继续探讨。