土荆皮乙酸促进喉癌细胞系HEp-2凋亡

杨蒙生，李 丽，刘雪峰，杨小龙

(甘肃省人民医院 耳鼻喉-头颈外科，甘肃 兰州 730000)

喉癌(laryngeal carcinoma)是人类头颈部常见的肿瘤之一，在中国其发病率排在22位，严重威胁人类健康[1]。土荆皮是金钱松(pseudolarix kamepferi gord)根皮或近根树皮，有杀虫止痒的作用，土荆皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是从土荆皮中提取的中药单体成分[2]，具有明显的抗肿瘤作用[3-4]。人喉表皮样癌细胞系(human larynx epithelial carci-noma cell line,HEp-2)来源于人类喉癌细胞，是体外研究喉癌发病的重要癌细胞系。本实验用土荆皮乙酸处理HEp-2细胞，探讨其诱导癌细胞凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

PAB(L8170，Sigma-Aldrich公司)；人喉表皮样癌细胞系HEp-2(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；PRMI 1640培养基、MTT和凋亡检测试剂盒(Solarbio公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、增强型化学发光试剂和SDS-PAGE凝胶试剂盒(Beyotime公司)；PVDF膜(Merck Millipore公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、PARP1和c-PARP1抗体(Abcam公司)；HRP标记的山羊抗兔二抗(CST公司)；DyLight594 标记的山羊抗兔二抗(GeneTex公司)；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理：用含10% FBS的1640培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养HEp-2细胞；待细胞至80%～90%汇合后，加入0.5%胰蛋白酶溶液消化细胞，以1∶3传代。取对数期细胞，胰蛋白酶消化，完全培养基配制成1×105个/mL的单细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔板中，待贴壁后，按文献[4]加入终浓度分别为0.5、1、2、4、8和16 μmol/L的PAB，以0.5% DMSO作为对照。

1.2.2 MTT实验:分别培养24、48和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃，5% CO2继续培养4 h；终止培养，吸去孔内培养液；每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min。在490 nm测量各孔的吸光度值。

1.2.3 流式细胞仪检测HEp-2细胞凋亡：根据MTT法实验结果，选择3个合适的PAB浓度加入处于对数期的细胞培养24 h后，胰蛋白酶消化，用PBS洗涤并悬浮细胞。计数后，取5×105个100 μL重悬的细胞，依次加入5 μL annexin V-FITC室温避光孵育10 min，加入10 μL PI避光孵育5 min，加入 PBS 至 500 μL，轻轻混匀。1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 qPCR检测Bcl-2、BAX和caspase-3 mRNA的表达：上述3个合适浓度的PAB加入处于对数期的细胞培养24 h后，加入Trizol裂解HEp-2细胞，用氯仿及异丙醇等提取总RNA。检测RNA浓度，并将其统一稀释至500 ng/mL，用反转录试剂盒进行反转录，获得的cDNA作为模板；实时荧光定量PCR试剂盒扩增目的基因(引物信息见表1)，每个反应设3个重复。反应条件：预变性，95 ℃ 10 min，1个循环；热循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40个循环。计算基因的相对表达量F=2-△△Ct。△△Ct=(待测样品的目的基因的Ct的平均值-待测样本的内参基因的Ct的平均值)-(对照样品的目的基因的Ct的平均值-对照样本的内参基因的Ct的平均值)。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot检测Bcl-2、BAX和caspase-3蛋白表达：选择上述3个合适浓度的PAB加入处于对数期的细胞培养24 h后，RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)裂解HEp-2细胞，提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度，4×上样缓冲液稀释，SDS-PAGE电泳、转膜后，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗1∶5 000，4 ℃静置过夜。洗涤后，HRP标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST漂洗，发光鉴定并分析结果。

1.2.6 免疫荧光检测HEp-2细胞PARP-1(poly ADP-ribose polymerase-1,DNA修复酶)和c-PARP-1(cleaved-PARP-1)蛋白的含量：上述3个合适浓度的PAB加入处于对数期的细胞培养24 h后，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% Triton-×100透膜15 min，5%山羊血清室温封闭30 min，c-PARP-1抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，洗涤，山羊抗兔的二抗 (1∶200)室温孵育2 h，洗涤，DAPI染色10 min，洗涤，荧光显微镜拍照分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PAB对 HEp-2细胞活性的作用

PAB对HEp-2细胞的增殖抑制呈时间和剂量效应关系(表2)。在24、48及72 h时，PAB对HEp-2细胞增殖抑制的IC50分别为3.01、2.26和1.65 μmol/L。

2.2 PAB对 HEp-2细胞凋亡的影响

随着PAB浓度的升高，HEp-2细胞的凋亡率逐渐升高(P<0.01)(图1,表3)。

表2 PAB对 HEp-2细胞活性的作用

2.3 PAB对Bcl-2、BAX、caspase-3蛋白及mRNA表达的影响

与对照组相比，随着PAB浓度的升高，HEp-2细胞中Bax、caspase-3蛋白及mRNA含量逐渐升高，Bcl-2蛋白及mRNA含量逐渐降低(图2，表4)。

图1 PAB对HEp-2细胞凋亡的影响

表3 PAB对 HEp-2细胞凋亡的影响

*P<0.01 compared with control.

图2 PAB对HEp-2细胞中Bcl-2、BAX、caspase-3蛋白及mRNA表达的影响

2.4 PAB对PARP-1、c-PARP-1蛋白表达的影响

与对照组相比，随着PAB浓度升高，HEp-2细胞中PARP-1蛋白含量逐渐降低，c-PARP-1蛋白含量逐渐升高，其中4和8 μmol/L PAB组细胞PARP-1含量降低和c-PARP-1含量明显升高(P<0.01)(图3,表5)。

3 讨论

约40%的喉癌患者确诊时已到了Ⅲ期或Ⅳ期[4]。目前喉癌的治疗包括手术治疗、放疗、化疗及生物治疗等[5-6]。化疗药物主要有顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇和甲氨蝶呤等[6]。但毒性大，化疗时间长，不良反应明显。开发新的抗肿瘤药物是目前研究的热点。

表4 PAB对Bcl-2、BAX、caspase-3蛋白及mRNA表达影响

*P<0.05，**P<0.01 compared with control.

图3 PAB对HEp-2细胞中PARP和c-PARP蛋白的影响

表5 PAB对HEp-2细胞中PARP和c-PARP蛋白的影响

*P<0.05 compared with control.

土荆皮乙酸(PAB)抑制肿瘤的机制复杂。PAB可通过降低微管的稳定性，抑制纺锤体的形成，诱导癌细胞G2/M期阻滞，导致细胞凋亡[7]。PAB还能降低抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达，激活caspase-3蛋白[8]。在体外它可抑制膀胱癌细胞系5637增殖，诱导其发生凋亡，其与PAB诱导survivin的表达下降，caspase-3的表达上升有关[9]。本研究显示PAB呈时间-浓度依赖的方式抑制喉癌细胞系HEp-2的增殖，诱导HEp-2细胞的凋亡。

在癌发生过程中，抗凋亡、促增殖蛋白表达的异常持续升高，导致细胞无法在DNA受损时死去，进而产生包含有DNA突变的细胞和子代细胞。机体一旦无法清除具有DNA突变的细胞，该类细胞最终发生癌变。因此，靶向诱导细胞凋亡在癌早期及晚期都具有重要的抗癌作用。目前研究比较成熟的细胞凋亡途径包括线粒体途径和凋亡受体途径。在线粒体凋亡途径中，Bcl-2和Bax蛋白的相对含量的变化扮演重要作用[10-11]。本研究发现PAB可在蛋白水平和mRNA水平提高HEp-2细胞中Bax表达，降低Bcl-2表达。由于线粒体膜通透性改变，线粒体内膜上的Cyt C释放到细胞质中，激活caspase级联途径，诱导细胞凋亡。caspase-3是caspase级联反应下游最关键的凋亡执行蛋白酶。激活的caspase-3可通过裂解PARP，激活由PARP负向调控的核酸内切酶，裂解核小体间DNA，启动细胞凋亡。本实验还发现PAB可诱导HEp-2细胞核中caspase-3的表达上升，总PARP含量减少，c-PARP含量升高。提示PAB可通过线粒体凋亡途径诱导HEp-2细胞凋亡。

综上可知，PAB可通过诱导线粒体凋亡途径激活caspase-3和Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶，导致DNA降解，诱导HEp-2细胞凋亡。但是土荆皮乙酸作为一种中药单体成分，对喉癌的抗肿瘤作用是否具有多靶向性还需进一步研究。