原料乳中嗜冷菌快速检测与控制技术研究进展

洪 青，李 楠，刘振民

（光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海乳业生物工程技术研究中心，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436）

嗜冷菌是一类能在7 ℃以下生长、20 ℃以下繁殖的细菌。原料乳中常见的嗜冷菌包括革兰氏阳性菌（芽孢杆菌属、链球菌属、乳杆菌属和李斯特菌属等）和革兰氏阴性菌（假单胞菌属、产碱杆菌属和黄杆菌属）以及一部分酵母菌和霉菌等[1]。与嗜温微生物细胞膜组成相比，嗜冷菌细胞膜中含有大量的直链和支链不饱和脂肪酸，由于脂肪熔点低的缘故，即使在较低温度下细胞膜仍能保持较强的流动性，吸收外来营养物质，用于菌体生长繁殖[2]。此外，参与新陈代谢的酶所需活化能较低，催化效率较高[3-4]，同时胞内存在冷激蛋白，这些均有利于嗜冷菌在低温条件下生长[5-6]。

1 原料乳中嗜冷菌的来源与危害

原料乳中嗜冷菌的污染主要为外源污染，包括源头污染和加工时的二次污染。嗜冷菌来源广泛，其在低温条件下能够生长，繁殖温度要求不高，因此未经处理的原料乳、不洁净的挤奶和贮藏设备、不合规卫生操作环境等均会带来大量嗜冷菌污染。

嗜冷菌污染的危害主要表现在嗜冷菌在原料乳贮藏期间会产生具有热稳定性的胞外蛋白酶、脂肪酶和碱性磷酸脂酶等，这些酶是影响产品品质的重要因素。蛋白酶和脂肪酶可持续水解乳蛋白和乳脂肪，生成苦味肽、氨基酸和脂肪酸等，引发凝结、蛋白质分层、风味、口感变差等品质问题。实际生产中发现，原料乳经巴氏杀菌后，嗜冷菌全部死亡，但产生的耐热蛋白酶和脂肪酶能够保持部分活性，甚至经过超高温加热处理后部分酶仍有活性，最终导致牛乳变质，影响乳品风味、质地及感官等品质[7]。

Yuan Lei等[8]发现，假单胞菌、沙雷氏菌和金黄杆菌产蛋白酶的能力较强，耶尔森氏菌所产蛋白酶的活力最高，不动杆菌产脂肪酶的能力较强。大量的蛋白酶及脂肪酶即使经高温热处理后仍有活性残留，热灭活动力学参数证实，经常规方法灭菌后，残留的蛋白酶仍对乳制品品质及货架期有潜在危害。Hantsis-Zacharov等[9]发现，绝大部分嗜冷菌能够产生脂肪酶或同时产生脂肪酶和蛋白酶，仅产蛋白酶的微生物很少，如假单胞菌属和不动杆菌属能够产生具有高活性的脂酶，细杆菌属能够产生具有高活性的蛋白酶和脂肪酶。

2 不同地区原料乳中嗜冷菌的菌群组成

嗜冷菌是影响乳及乳制品品质优劣的重要因素，原料乳从挤奶到加工前需保持低温条件运输和贮藏，由于嗜冷菌能分泌蛋白酶和脂肪酶等，因此低温条件下也能导致生鲜乳变质，我国现行的GB 19301—2010《食品安全国家标准 生乳》仅对菌落总数做了限量规定（2×106CFU/mL），没有针对嗜冷菌的限量指标。在乳品企业实际生产中，根据原料乳品质等级，嗜冷菌限量值一般保持在103～105CFU/mL以下。

雷鸣等[10]研究表明，原料乳微生物中的拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）丰度最高，拟杆菌门主要为黄杆菌属（相对丰度47.66%）和金黄杆菌属，变形菌门包括假单胞菌属（相对丰度39.54%）、不动杆菌属（相对丰度3.77%）、嗜冷杆菌属（相对丰度0.55%）、醋酸杆菌属和摩根氏菌属；4 ℃条件下贮藏24 h，原料乳中菌落总数为（1.5～1.8）×105CFU/mL，嗜冷菌数为（1.0～1.3）×105CFU/mL，1 0 ℃条件下贮藏2 4 h，原料乳中嗜冷菌数为106CFU/mL。15 ℃条件下贮藏24 h，嗜冷菌数超过2×106CFU/mL。北京地区原料乳中乳酸乳球菌占比较高，生物多样性较低；北京、哈尔滨和黑河3 个地区原料乳中的优势菌群为乳杆菌属和假单胞菌属，包括假单胞菌、不动杆菌、乳杆菌、链球菌和肠球菌；3 个地区原料乳中均发现芽孢杆菌，可能由储奶罐、原料乳运输管道和罐装机器引入；该研究还发现，相同贮藏条件下，同一地区的原料乳相似度高于同一贮藏时间的原料乳[11]。

Li Nan等[12]研究表明，上海地区6月份原料乳的细菌生物多样性最高，12月份最低，所含嗜冷菌主要为厚壁菌门、变形菌门和放线菌门，假单胞菌属、乳杆菌属和不动杆菌属相对丰度最高，低温贮藏时原料乳中假单胞菌属、丙酸菌属和黄杆菌属相对丰度较高，假单胞菌/丙酸菌、乳杆菌/双歧杆菌分别具有协同效应；丙酸菌属和假交替单胞菌属与菌落总数呈负相关，有助于监控原料乳质量；温度和湿度是影响原料乳微生物菌群变化的决定性因素，温度较低的季节放线菌门相对丰度较高，温度较高的季节厚壁菌门相对丰度较高，湿度较低的季节拟杆菌门相对丰度较高，湿度较高的季节变形菌门相对丰度较高。浙江地区原料乳中分离得到假单胞菌、类黄假单胞菌、荧光假单胞菌和乳酸菌等种属，其中假单胞菌属菌株有13 株，为嗜冷菌中的优势菌群[13]。

国外原料乳的菌落组成也各不相同，巴西巴拉那牧场原料乳中分离的嗜冷菌中，产蛋白酶的嗜冷菌包括乳酸乳球菌（27.3%）、神户肠杆菌（14.8%）、解脲沙雷氏菌（8.0%）、马脲气球菌（6.8%）和地衣芽孢杆菌（6.8%）；产脂肪酶的嗜冷菌包括神户肠杆菌（17.7%）、乳酸乳球菌（15.6%）、马脲气球菌（12.5%）和鲁氏不动杆菌（9.4%），菌落总数平均值为1.5×105CFU/mL，嗜冷菌数平均值为1.1×104CFU/mL，占比78.3%[14]。Ercolini等[15]从意大利牧场原料乳中分离得到66 株菌，假单胞菌和肠杆菌是最常见的嗜冷菌，50%革兰氏阴性菌和65%假单胞菌能在5 ℃条件下生长，13 株革兰氏阴性菌（主要为假单胞菌）所产蛋白酶在7 、20 ℃条件下均有活力；菌落总数为5.0×103～6.0×105CFU/mL，嗜冷菌总数为1.2×103～1.6×105CFU/mL。Hantsis-Zacharov等[9]发现，法国牧场原料乳中优势菌群（假单胞菌属、不动杆菌属、明串珠菌属、乳球菌属和细杆菌属）在4 个季节均存在，其中春季和冬季优势菌群为丙型变形菌纲，夏季优势菌群为芽孢杆菌纲，秋季优势菌群为放线菌纲，全年菌落总数平均值为（4.8±2.3）×104CFU/mL，嗜冷菌数平均值为7×103CFU/mL，占比（14.7±6.4）%。以上研究表明，地区、季节和湿度对原料乳中嗜冷菌的组成和数量具有显著影响。

3 原料乳中嗜冷菌的快速检测技术

乳及乳制品中嗜冷菌的菌落总数标准测定方法为NY/T 1331—2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》中的MPC平板计数法，乳样于6.5 ℃条件下培养10 d，该法计数结果准确，但实验周期长，无法在实际工业生产中广泛使用。目前，国内外开发出基于微生物学、化学、生物化学等的原料乳中微生物快速检测方法，包括直接检测法（直接荧光过滤法、流式细胞术和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法等）和间接检测法（脂肪酶法、氨肽酶法和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法等），各方法优劣不一。国内乳品企业一般利用微生物检测仪或流式细胞仪对原料乳中的微生物进行快速测定，但尚未有合理、便捷、快速、廉价的方法测定原料乳中的蛋白酶和脂肪酶等。

原料乳中嗜冷菌的快速检测包括直接检测法和间接检测法，其中直接检测法包括流式细胞术、直接荧光过滤法、实时荧光定量PCR、荧光原位杂交技术及等温扩增技术等，间接检测法包括游离脂肪酸测定、氨肽酶活性测定、ELISA及电阻抗法等。此外，低温贮藏条件下原料乳中的嗜冷菌数与菌落总数呈一定线性关系，因此可以利用现有的原料乳中菌落总数快速测定方法，基于数学模型构建原料乳中嗜冷菌数的快速预测方法，评估原料乳污染情况[16-17]。多种快速检测方法在原料乳嗜冷菌和菌落总数检测中的应用如表1所示，包括检测时间、检测限、检测相关系数、优势和不足。

表1 原料乳中嗜冷菌和菌落总数快速检测方法Table 1Comparative evaluation of rapid detection methods for psychrophilic bacterial and total bacterial counts in raw milk

4 原料乳中嗜冷菌的控制技术

嗜冷菌控制技术通常覆盖乳制品全产业链，包括乳源、加工、冷链物流和销售等环节，因此乳品企业的控制手段通常包括干净卫生的生产环境、标准规范的挤奶操作、清洗消毒挤奶设备、定期检查容器卫生、完善的冷链和实验室质量管理监控等。工业化生产常采用低温杀菌法进行预杀菌，以保证原料乳质量，目前随着优质乳工程的开展，部分乳品企业的优质乳源可直接低温贮藏，不需要进行预杀菌处理。当贮藏温度为4 ℃左右时，嗜冷菌表现出较长的延滞期与代时。雷鸣等[10]利用16S rRNA高通量测序发现，4 ℃冷藏1 d后，原料乳中的嗜冷菌相对含量超过90%，嗜冷菌成为原料乳中的优势菌，低温贮藏条件为4 ℃（≤24 h）、10 ℃（≤16 h）、15 ℃（≤8 h）时，原料乳中的菌落总数能满足生乳的食品安全国家标准，嗜冷菌不会大量增殖。

国外对生鲜乳中嗜冷菌的源头防控措施研究较早，美国食品药品管理局颁布了“A”级巴氏杀菌乳条例，建立了包括乳的取样、搬运和运输、奶场建造、乳品生产标准、水源标准、人员清洁、设备装置测试和农产监管等在内的整体质量体系[30]。同时，国外乳业还开发利用超声波、脉冲电场、超高压均质、膜过滤及超临界二氧化碳等非热处理技术，降低乳中微生物、蛋白酶及脂肪酶活力，保障提升乳制品品质标准[31-32]。与常规的加热灭菌技术相比，高压处理技术可以提高乳品的微生物安全性，延长其货架期[33]，25 ℃、450 MPa超高压处理20 min，莓实假单胞菌活菌数降低，蛋白酶活力降低14%，温度提高至50 ℃，酶活力降低40%[34]。

微生物溯源是通过比较目标样品与可能污染源中微生物的差异以确定污染源，生态环境的变化和外来物种的引进加速了菌种变异，导致新的病原微生物出现，其传播途径和机会也在扩大。美国和欧盟等已开展相关研究工作，我国还处于起步阶段。原料乳中嗜冷菌污染的溯源需要对乳样、牛乳房、挤奶装置、输送管道、奶罐、饲料等整个原料乳生产链进行采样，将全部微生物进行培养、筛选和测序分析，建立表型和基因型数据库[35]。传统的细菌培养法和表型分析法每次只能确定1 种微生物，费时费力，难以实现快速测定。伴随分子生物学和测序技术的发展，基因分型方法以其灵敏度高、特异性强和分型率佳等优点逐渐代替表型分型技术，如核糖体分析、随机扩增多态性分析、重复序列扩增分析、脉冲场凝胶电泳分析和基于全基因组测序的单核苷酸多态性分析等技术[36]。目前这些技术仍有不足之处，如随机扩增多态性分析受引物和反应条件影响、核糖体分型设备要求高、脉冲场凝胶电泳技术要求高且耗时等。随着测序成本的大幅降低以及微生物序列比对数据库和测序数据软件的日趋完善，在开发建立嗜冷菌快速检测方法的基础上，溯源网络的构建能够对乳及乳制品的品质保障提供有力支撑。

5 结 语

嗜冷菌多样性污染是影响乳及乳制品质量安全的关键因素，建立开发精准、便捷的嗜冷菌检测方法是有效制定嗜冷菌污染解决措施的必要前提。目前的嗜冷菌快速检测方法在实验室阶段效果良好，但由于操作复杂、成本高或特异性不强等原因，部分方法无法在实际生产中进行规模化应用。随着分子生物学的发展，建立完善嗜冷菌数据库、基于分子分型、代谢物指纹图谱等方法建立种水平甚至亚种水平上的嗜冷菌鉴别和溯源技术是未来乳品安全研究的重要方向，能够为乳制品全产业链的品质保障提供技术支撑。