同步荧光结合主成分与二维相关研究盐碱性土溶解性有机质组成与结构特征

陈营营， 郑昭佩， 杨 芳， 白 杨， 于会彬

1. 山东师范大学地理与环境学院， 山东 济南 250014 2. 中国环境科学研究院流域水环境污染综合治理研究中心， 北京 100012

引 言

土壤溶解性有机质(soil dissolved organic matter, SDOM)是一种复杂混合物， 具有多种生态功能和地球化学特征， 是地球多个圈层间的联系枢纽[1]。 SDOM对营养物与污染物的迁移转化及碳循环有重要影响， SDOM含量与质量深受物理、 化学和生物、 过程的控制[2-4]。 因此， SDOM被视为评估生态环境的重要指标。

C13核磁共振、 高效液相色谱、 红外光谱、 紫外可见光谱与荧光光谱等被用来研究SDOM组成与结构特征[5-8]。 荧光光谱具有检测速度快、 不改变样品性状、 成本低与信息量大等优点[7-8]， 广泛应用于表征SDOM中的芳香族氨基酸、 腐殖质等荧光类物质[9]。 通过传统的寻峰法， SDOM表征类蛋白、 微生物代谢产物及腐殖酸类物质[10]。 由于荧光峰的叠加而降低了光谱的分辨率， 在SDOM的分析应用中存在着一定的局限性。 应用二维相关方法来分析同步荧光光谱(synchronous fluorescence spectroscopy， SFS)， 不仅通过放大波段信号而分解重叠峰， 而且能够区分外部扰动而引起的细微光谱变化顺序[10-11]。 此外， PCA已被广泛应用到SFS中， 将复杂的光谱信号分解成线性独立分量， 而且表征样本的相似性和差异性特征。

本研究利用SFS结合PCA与二维相关光谱， 分析盐碱土DOM组成与结构特征， 揭示荧光组分的空间分异规律， 阐释荧光组分响应关系及迁移转化机制。

1 实验部分

1.1 研究区域

河套灌区位于内蒙古自治区巴彦淖尔市境内， 灌区东西长250 km， 南北宽50 km， 总灌溉面积5 740 km2。 灌区属温带大陆性季风气候， 夏季高温干旱， 冬季严寒少雪。 多年平均气温在3.7～7.6 ℃。 降雨多集中在7、 8月份， 多为暴雨。 年均降水量为130～285 mm， 年均蒸发量为2 030～3 180 mm。 受地质构造、 灌溉、 排水与气候等因素影响， 灌区内土壤盐碱化现象普遍存在。

1.2 样本采集

在灌区采集芦苇(LW)、 白杨(LD)、 玉米(YM)和籽瓜(GD)四种植被下覆盖的土壤为研究对象， 按0～20, 20～40, 40～60, 60～80 cm等四层采集样品共计16个。 土壤样品自然风干后研磨过100目筛。 将20 g土壤样品与100 mL超纯水(Milli-Q， 电阻率为18.2 MΩ·cm)混合， 恒温避光连续震荡24 h， 用离心机7 000 r·min-1离心10 min， 将上清液过0.45 μm醋酸纤维膜， 得到SDOM溶液。

1.3 同步荧光测定

采用荧光分光光度计(HitachiF-7000, Japan)进行同步荧光光谱测定， 激发光源为150 W氙弧灯, 光电倍增管电压为700 V。 SFS激发波长范围为260～545 nm， 狭缝5 nm， 响应时间为0.5 s， 波长差常数Δλ=λem-λex=55 nm， 扫描速度240 nm·min-1。

1.4 二维相关光谱

运用Kwansei-Gakuin大学发布的2D shige软件， 对SFS数据进行二维相关光谱分析， 采样点土壤剖面深度为外部扰动因素。 二维相关的读谱规则参阅相关文献[12]。

2 结果与讨论

2.1 同步荧光光谱

SFS显示出4个不同强度的峰(图1)， 第一个峰在激发波长260～310 nm之间与类蛋白物质有关, 而类蛋白物质与酪氨酸和色氨酸的存在密切相关； 第二个峰表示微生物代谢产物， 其波长在315～340 nm之间； 第三个峰与富里酸有关， 波长340～400 nm； 第四个峰波长在410～450 nm之间， 与胡敏酸对应[11]。 芦苇与林地SDOM荧光强度明显小于玉米与瓜地SDOM荧光强度， 表明SDOM深受人类活动的影响。 玉米SDOM荧光强度明显高于瓜地SDOM， 与玉米秸秆含有较高的木质纤维素具有一定相关性[13]。 芦苇、 玉米与林地的SDOM荧光强度随着土层深度的增大而减小， 而瓜地SDOM荧光强度随着土层深度的增加而增加， 表明瓜地水浇过程中土层以淋溶作用为主， 而其他土层以渗滤作用为主[14]。

图1 4种土壤中提取的16个DOM样品的SFS

2.2 主成分分析

应用PCA分析 SFS数据得到因子得分与因子载荷， 因子得分与波长的关系图提供了每个PC的光谱波形的变化迹象， 从而识别出导致光谱信号差异的荧光团， 而载荷量可以表征样本空间分布的差异[10-11]。 在PCA中Kaiser-Meyer-Olkin (KMO)决定抽样充分性， 对于可接受的PCA， 抽样充分性应大于0.5， Bartlett的球度检验(P)是检验种群相关矩阵中变量不相关的零假设的另一个指标， 观测到的显著性水平应p<0.001[10-11]。 在本研究中， KMO数值是0.927， 并且p<0.001， 表明PCA处理数据可行。

PCA得到两个主成分(PCs)， 占总方差的99.31%(图2)。 PC1(55.43%)识别出3个荧光峰， 即在波长273， 301和324 nm处， 分别与酪氨酸、 色氨酸和微生物代谢产物对应[11]。 PC2(43.88%)显示了2个尖峰和1个肩峰。 第一个尖峰(277 nm)代表酪氨酸， 与PC1相比发生了4 nm的红移， 表明瓜地土壤中的酪氨酸荧光强度明显高于其他三种植被土壤的酪氨酸荧光强度(图1)； 第二个尖峰(366 nm)与富里酸组分对应； 421nm处的肩峰代表胡敏酸[11]。 每个PC上光谱的负载表明每个PC与单个SFS相关(图1)， 这证明PC捕获了荧光光谱的特征。

图2 16个土壤样品光谱波长PC1和PC2的得分图

图3为SDOM同步荧光光谱的因子载荷图， 对角线将所有样本分为两个部分， 左上方为玉米与瓜地土壤样本， 右下方为林地与芦苇地样本(除YM03、 YM04)， 说明农作物与非农作物间SDOM荧光特征具有显著差异。 以得分值0.7为截点， 可将对角线上方与下方各分为两个区域， 如图3所示。 区域Ⅰ包括7个样品(LW01-03， LD02-04， YM04)， PC1负荷>0.8， PC2负荷<0.6， 说明类蛋白物质(酪氨酸和色氨酸)荧光团占优势； 区域Ⅱ(YM 03， LW 04和LD 01)的PC1负荷量相对较高(>0.75)， 与微生物代谢产物荧光团相对应； 区域Ⅲ(YM01-02和GD01)的PC2负荷量相比于PC1负荷量较多， 以富里酸为主。 区域Ⅳ(GD02-04)的PC2负荷>0.8， PC1负荷<0.55， 三个SDOM样品中胡敏酸荧光团占优势。

图3 因子载荷图

2.3 同步二维相关光谱

运用2D Shige 软件对SFS进行二维相关分析， 减少光谱重叠的影响， 分析SDOM组分的空间变化特征。 在同步二维相关光谱中， 主对角线上的峰称为自动峰， 自动峰总为正值。 自动峰代表了系统在外扰条件影响下， 随着光强变化不同区域相关光谱变化的敏感性[13]。 位于对角线两侧的光谱峰则称作交叉峰， 表示自动峰间的同步变化， 白色代表正相关， 阴影代表负相关， 交叉峰的存在意味着自动峰间的变化有着共同的起源[11-12]。

以土壤剖面深度为扰动因素， 分析出四种植被覆盖土壤的同步二维相关光谱图(图4)。 LW显示出两个显著的自动峰(303和337 nm)， 且两者之间变化趋势为正相关， 表明芦苇土壤中色氨酸与微生物代谢产物呈正相关； YM显示出一个显著(350 nm)与一个微弱(420 nm)自动峰， 分别与富里酸和胡敏酸对应， 且两者间呈正相关； LD表现出三个自动峰位于284， 346和426 nm处， 分别对应酪氨酸、 富里酸与胡敏酸， 且交叉峰为白色。 表明三者之间均呈正相关， 即富里酸随着外扰因素土壤剖面深度的增加而减少时， 酪氨酸与胡敏酸的变化趋势与富里酸一致， 这与SFS是对应的(图1 LD)。 GD与其他三种植被土壤有着显著差异， 表现出两个显著自动峰(275和355 nm)和一个微弱自动峰(410 nm)。 在两个显著自动峰间的交叉峰为阴影， 表明酪氨酸与富里酸呈负相关， 而富里酸与胡敏酸(410 nm)呈正相关。

2.4 异步二维相关光谱

在异步相关光谱中， 相关峰是关于主对角线反对称的， 只在对角线外存在交叉峰， 没有自动峰的形成。 异步相关光谱中的交叉锋特性可以帮助区分紧密靠近重叠在一起的起源不同的峰， 异步交叉峰的值可正可负[12-13]。

图4 以土壤剖面为扰动的4种土壤的同步二维相关光谱图

图5表征的是四种植被土壤的异步二维相关光谱图， 与同步二维相关光谱图相比， 组分数量表现出明显差异。 在LW中显示出三个交叉峰(对角线上方)， 位于290/337， 321/337和337/370处。 根据二维相关图谱解析规则， 得到波段变化顺序为370 nm→337 nm→290 nm， 表明随着扰动因素剖面深度的变化， 荧光组分的变化顺序为富里酸→微生物代谢产物→色氨酸； YM的异步相关图显示出两个显著交叉峰(274/350和350/420)和两个微弱交叉峰(318/350和420/470)， 波段变化为318 nm→350 nm→420 nm→274 nm。 证明微生物代谢产物变化最快， 其次是富里酸、 胡敏酸和酪氨酸； LD显示四个显著交叉峰(270/337， 305/325， 337/426， 426/392)， 波段变化为270 nm→392 nm→426 nm→305 nm→337 nm， 所以LD剖面中组分变化顺序为酪氨酸→富里酸→胡敏酸→色氨酸→微生物代谢产物。 GD的异步相关光谱相对复杂， 表现出强弱不同交叉峰五个， 分别位于262/275， 275/309， 275/355， 334/410和402/455， 波段变化顺序为

410 nm→355 nm→334 nm→309 nm→275 nm， 对应荧光组分变化顺序为胡敏酸→富里酸→微生物代谢产物→色氨酸→酪氨酸。

图5 以土壤剖面为扰动的4种土壤的异步二维相关光谱图

3 结 论

四种植被的SDOM主要含有酪氨酸、 色氨酸、 微生物代谢产物、 富里酸和胡敏酸等5种荧光组分。 瓜地和玉米地SDOM荧光强度大于林地和芦苇SDOM的荧光强度， 瓜地SDOM荧光强度随着土层深度的增大而增大， 而其他三种植被SDOM的荧光强度随着土壤深度的增大而减小， 表明瓜地水浇过程中土层以淋溶作用为主， 而其他土层以渗滤作用为主。 芦苇SDOM中的色氨酸与微生物代谢产物呈正相关， 且荧光组分的变化速度顺序为富里酸→微生物代谢产物→色氨酸； 玉米SDOM中富里酸与胡敏酸呈正相关， 且微生物代谢产物变化最快， 其次是富里酸、 胡敏酸和酪氨酸； 林地SDOM中的酪氨酸、 富里酸和胡敏酸呈正相关， 且组分变化顺序为酪氨酸→富里酸→胡敏酸→色氨酸→微生物代谢产物； 瓜地SDOM中的富里酸与胡敏酸呈正相关， 而与酪氨酸呈负相关， 胡敏酸变化最快， 其次是富里酸、 微生物代谢产物、 色氨酸与酪氨酸。