间充质干细胞在再生障碍性贫血治疗中的研究进展

洪 扬，王金霞，李方林，陈懿建

(1.赣南医学院 a.2017级硕士研究生；b.第一附属医院血液科，江西 赣州 341000；2.南昌大学医学院，江西 南昌 330000)

再生障碍性贫血(Aplastic Anemia, AA)是一种以骨髓发育不全和外周血全血细胞减少为特征的骨髓衰竭综合征[1]。患者往往依赖于血液的输注，未及时治疗易导致死亡，最常见的是感染或出血[2]。目前治疗主要集中在造血干细胞(hemopoietic stem cells, HSCs)移植或抑制免疫介导的骨髓干细胞破坏。已有研究表明再生障碍性贫血患者间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)的体外造血支持作用和免疫抑制能力显著降低。骨髓基质的间充质基质细胞(Mesenchymal stromal cells, MSCs)为HSCs提供了一个利基，在调节和维持造血中起着重要的作用。目前已有较成熟的体外分离、培养、增殖MSCs的方法，研究发现MSCs输注可以恢复骨髓造血微环境、产生多种细胞因子，MSCs还在调节移植免疫方面发挥着重要作用，可以降低移植物抗宿主病(Graft versus host disease, GVHD)的发生。本文就MSCs免疫特性及其在再障中的研究作一综述。导致AA骨髓造血衰竭的确切机制尚不清楚，可能包括:原发性HSCs缺陷、免疫介导的造血抑制、BM微环境缺陷或两者的结合[3]。目前再生障碍性贫血的治疗方法为雄激素、免疫抑制治疗或造血干细胞移植。最新研究表明孢素A(Cyclosporin A, CsA)联合抗胸腺细胞IST(immunosuppressive therapy, IST)可明显改善重型再生障球蛋白(Antithymocyte globulin, ATG)的免疫抑制治疗碍性贫血(Severe aplastic anemia, SAA)患者的生存率，但只对40%～60%患者有效[4]，免疫抑制治疗的目的在于通过抑制异常活化的T细胞，避免造血组织的进一步损伤，促进受损的造血干/祖细胞恢复造血[5]。但是造血干细胞移植仍然是治疗再障的一线选择，但由于我国独生子女比较多，人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)相合配型比较困难，且费用昂贵，5%～15%的患者因GVHD影响生活质量。因此有必要探索一种新的治疗手段[6]。研究表明间充质干细胞是一种多能干细胞,能够与造血干细胞相互作用,提供造血干细胞生长所需的基质及生长因子、改善造血微环境，恢复骨髓造血功能。

1 再生障碍性贫血

1.1再障患者MSCs的异常最新研究结果表明，骨髓间充质干细胞功能缺陷可能与再生障碍性贫血的发病机制有关，骨髓间充质干细胞作为造血微环境的重要组成部分，功能缺陷可能导致造血微环境紊乱，为了验证这一假说，我们将再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的基本特征与对照组进行了比较，以确定再生障碍性贫血病理生理过程中骨髓间充质干细胞的变化。研究发现[7]AA患者骨髓间充质干细胞明显异常,表现为分化缺陷、血管生成减少、骨髓脂肪化。基因表达谱分析发现，与健康对照组相比，AA患者骨髓间充质干细胞中有300多个基因差异性表达[8]：这包括细胞凋亡和免疫应答相关基因的上调[8]，此外AA患者骨髓间充质干细胞通过趋化因子(CXCL12)和成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF1)表达下调[9-10]而降低其增殖潜能。再生障碍性贫血患者及对照组骨髓间充质干细胞成脂后的表达，与对照组相比，再生障碍性贫血患者脂肪细胞内脂肪滴较少，体积较小。

1.2 MSCs在再障小鼠模型中的研究李佩恩等[11]将人骨髓 MSCs(1×106/只)输注给 AA小鼠,21 d后治疗组血象逐渐恢复，而模型组血象未恢复，小鼠股骨病理切片显示治疗组脂肪细胞比例明显低于AA模型组，与单纯照射组结果一致。董毅等[12]将MSCs(1×106/只)输注给AA小鼠后28 d后模型组小鼠存活率为20%，而MSCs治疗组存活率73.3%，外周血象14 d后MSCs输注组已开始恢复,28 d恢复正常,而模型组血象仍未恢复。通过动物实验表明间充质干细胞输注，治疗再障小鼠有效，与正常小鼠相比较SAA小鼠的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)的细胞形态学发生了改变：MSCs体积明显增大,呈平铺、边界不清，和正常小鼠的骨髓间充质干细胞明显不同[13]。王萍等[14]在动物实验中发现HSCs联合MSCs输注可显著提升外周血及骨髓中有核细胞数量,并且证明输注的MSCs可长期存在于造血微环境中。有研究发现，接受致死剂量放疗，导致骨髓抑制的小鼠，MSCs后骨髓可恢复造血功能,MSCs的作用在输注的早期即可起效[15]。

2 间充质干细胞治疗再障的机制

2.1 MSCs的免疫调节作用1996年Friedenstein发现了间充质干细胞(MSCs)[16]，MSCs在造血干细胞的存活和分化过程中，作为BM微环境的重要组成部分。间充质干细胞(MSCs)来源广泛,易于分离、培养及扩增，有着多向分化潜能、低免疫原性，易于接受外源基因的导入，广泛的用于组织工程细胞和基因载体细胞[17]，间充质干细胞能够增强造血干细胞移植后的植入，能够自我复制，与造血干细胞相互作用，提供造血干细胞生长所需的基质及生长因子，还能调节机体的免疫功能。研究表明，脐血和胎儿骨髓间充质干细胞对不同的T细胞亚群具有调节免疫活性[18]，CD4 T细胞介导的细胞免疫被认为是获得性急性干细胞破坏的主要机制。MSCs调节免疫反应的机制包括与各种免疫细胞相互作用，在不同的微环境中分泌可溶性介质[19-20]。此外间充质干细胞具有低免疫原性，抑制免疫排斥反应，促进免疫重建。MSCs不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(Major histocompatibility complex, MHCII)、B7-1、B7-2、CD40、CD40L及Fas配体。因此很难被机体的免疫系统识别，这为间充质干细胞的临床应用打下基础。骨髓间充质干细胞对T细胞、NK细胞和抗原提呈细胞，具有显著的免疫抑制作用。

2.2 MSCs改善人造血微环境骨髓造血微环境由骨基质细胞、胞外基质及一些细胞因子等组成。骨髓基质细胞包括骨髓间充质干细胞(BMSC)以及一些较成熟细胞，如成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成骨细胞等,通过分泌某些细胞因子调控HSCs的生理功能。以往的研究表明，获得性AA表现为造血干/祖细胞(Hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells, hSCs/hpcs)和造血微环境的异常，而造血微环境通常是由免疫异常介导的[21]。现有研究发现，AA患者的造血干/祖细胞在多种生物学特性和功能上存在缺陷，骨髓间充质干细胞作为骨髓微环境的关键前体细胞，在血细胞形成过程中起着重要的作，MSCs分化为多种基质细胞构成HSCs生态位，分化后的MSCs支持造血，几乎调节全身免疫细胞功能，维持机体免疫稳态。BM-MSCs在维持长期造血中起着重要作用，有研究表明，骨髓间充质干细胞缺陷可抑制造血功能。Fouillard L等报道[22]1例6岁的难治性AA患者，无法进行造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HCT)治疗，并先后两次接受其子的MSCs输注,不幸的是，患者死于大量感染，但尸检显示骨髓基质有所改善，但造血没有明显改善[23]。在另一项研究中，18例患者接受了第三方骨髓间充质干细胞的注射，33%的患者至少对治疗有部分反应，避免了输血的需要[24]。另一研究采用了每周注射骨髓间充质干细胞的方法，但发现骨髓移植不良。然而在这9例患者中3例确实有部分反应，并能够独立输血。最近研究发现[24]53例患者在体外扩增后接受了来自匹配、半相合或无关供体的骨髓间充质干细胞，MSCs输注在1年时，总有效率为28.4%。这些初步研究支持MSCs改善骨髓基质，减轻部分AA患者的症状。

2.3 MSCs分泌多种细胞因子支持造血作用MSCs通过分泌各种细胞因子和可溶性分子对免疫系统具有抑制或调节作用，这些可溶性分子可以迁移到特定的受损部位发挥长时间免疫调节效应。这对于AA改善骨髓微环境、保护造血干细胞和祖细胞尤为重要。据推测，骨髓间充质干细胞缺陷可能会阻止足够的造血功能。此外MSCs还可以产生多种具有调控和支持造血的物质：如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、白介素(Interleukin, IL-Ii)等多种黏附分子。在AA患者中，骨髓间充质干细胞具有抑制增殖和分化潜能，并且缺乏抑制T淋巴细胞活化、增殖和释放细胞因子的能力。在体外研究中[25]MSCs可以通过G0/G1期阻断活化的T细胞(CD4和CD8细胞)的增殖。间充质干细胞存在于骨髓非造血组织中,具有高度增殖、自我更新及多项分化潜能，对T淋巴细胞具有较强的免疫抑制作用。AA患者体内的干细胞增殖潜能较弱,对造血岛形成的支持作较差。Xiao等[26]报道了18例接受MSCs治疗的难治性AA患者，随访1年6例患者(33.3%)完全缓解(complete remission, CR)或部分缓解(Partial remission, PR)，而对照组中仅1例患者达到部分缓解。CHEN等[27]研究发现MSCs促进HSCs植活并可能加速造血恢复，MSCs分泌SDF-1使HSCs通过SDF-1/CXCR4轴进入骨髓，HOXB4可促进HSCs自我更新MSCs分泌的基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和HOXB4均能促进射线照射后小鼠的造血恢复，WBC、PLT、HGB在外周血及骨髓中均快速恢复，这表明MSCs联合HSCs治疗再生障碍性贫血是安全可行的，但其具体机制还需进一步研究。

3 MSCs联合HSCs治疗AA

MSCs是骨髓造血微环境的重要成分,具有促进造血干细胞的分化和增殖、抗炎、修复损伤组织、调节机体免疫等作用。最新动物实验及部分临床实验证实，MSCs联合HSCT输注有助于可提高AA患者的造血重建率及免疫功能，减轻GVHD和移植后排斥反应[28]。MSCs输注在HSCs输注前后也被预先使用；这种方法缩短了植入时间，中性粒细胞和血小板在造血干细胞移植(HSCT)后12天植入，短于历史对照组[29]。另外包括半相合供体HSCT在内的替代供体移植骨髓间充质干细胞加入方案后[30]，植入时间较短。LIU等最近的一项Ⅱ期研究[31]证实了这些发现，当骨髓来源的间充质干细胞给予半相合HSCT时，97.6%的患者造血功能有所恢复，但是这些都是小样本研究，还需进一步研究。另外WANG等[32]研究证实了半相合HSCT联合MSCs输注治疗复发难治性血液病的有效性。

4 MSCs 治疗 GVHD

GVHD仍然是限制广泛使用异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)的原因之一，是危及生命的并发症[33]。HSCT与供体来源的脐带间充质干细胞联合应用是安全可行的，MSCs输注有利于恢复造血功能、减少感染的发生、降低死亡率，降低GVHD的严重程度。比利时的一项研究表明[34]，骨髓间充质干细胞输注显著降低了急性移植物抗宿主病(Acute graft versus host diseasea, GVHD)的发生率。MSCs不仅能抑制T细胞的增殖和活化，而且还能调节辅助T细胞(Regulating helper T cells)的分化，调节性T细胞(Tregs)作为辅助性细胞的重要亚群，在诱导外周免疫耐受中起着至关重要的作用，骨髓间充质干细胞能促进Tregs的产生降低GVHD的发生。间充质干细胞联合骨髓和外周血干细胞移植能够改善骨髓微环境，促进造血植入，进一步降低移植物抗宿主病发生率。

5 结 语

综上所述，越来越多的研究表明，间充质干细胞可促进移植造血干细胞的归巢，改善造血微环境，产生多种细胞因子，加速造血功能的恢复，降低GVHD的发生。间充质干细胞在AA治疗中有着显著的疗效。但是不同的研究对MSCs的治疗效果评价不尽相同，多数研究表明MSCs具有良好的细胞治疗前景，但仍有诸多困难有待攻克：首先还没有建立规范的MSCs生产流程，MSCs输注的种类、剂量、频次、间隔时间等尚没有统一意见；其次针对间充质干细胞的安全性和有效性、有无并发症等问题，目前尚缺乏足够、可靠的临床依据，以及如何建立有效的扩增体系以满足MSCs的临床需要。随着对间充质干细胞深入研究，将为临床应用打下坚实的基础。总之，充分探索间充质干细胞的免疫学特性和所存在的问题，将有望为临床治疗AA开阔新的前景、创造新的希望。