正交试验设计在茶叶铁、锌、铜含量测定中的应用

邓波，王莎，吴汉奇

（1.川北医学院预防医学系，四川南充637000；2.岳池县人民医院，四川岳池638300）

茶叶在我国具有悠久的历史，是国人喜爱的天然饮品之一。近年来，随着人们生活水平和认知水平的提高，人们也日益关注茶叶的质量，茶叶的营养与安全问题已成为目前老百姓关注的热点之一。

铁、锌、铜均是人体必不可缺的微量元素，是人体的重要组成成分，对人体的健康起着不可忽视的重要作用。但是当其的摄入过低或过量的时候，就会对人体健康造成一定的不良影响，对人体产生伤害。所以，对茶叶中的锌、铁、铜元素的检测可以了解茶叶中相关金属元素的含量，对人们的健康具有现实意义。根据国家标准GB 5009.90-2016《食品安全国家标准食品中铁的测定》[1]、GB 5009.14-2017《食品安全国家标准食品中锌的测定》[2]，和GB 5009.13-2017《食品安全国家标准食品中铜的测定》[3]，对食品中铁、锌、铜的测定方法主要有：电感耦合等离子体质谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法。采用火焰原子吸收光谱法测定铁、锌、铜含量，具有灵敏度高、准确性好、方法简单、结果精确等优点[4-5]。同时，微波消解技术是最近几年新兴的一种高效的样品前处理技术，是目前应用较多的一种方法。因其具有耗时短、消解彻底、能快速处理大量样品、且准确度高等优点[6]，近年来被广泛应用。然而影响微波消解效果的因素很多，如样品的种类、消解剂的种类及含量、消解压力、爬坡时间、功率等。并且微波消解条件的设置是否合适，与样品前处理的效果直接相关，且影响着样品中金属元素检测结果的真实性和可靠性。正交试验设计正是利用一套规格化的正交表安排试验，能在多试验条件中选出代表性强的少数试验方案，通过对这些少数试验方案结果的分析，从中找出最优方案，此法已被广泛应用[7-11]。因此，本研究通过正交试验设计对茶叶中铁、锌、铜含量测定的微波消解条件进行优化，建立火焰原子吸收光谱法准确测定茶叶中铁、锌、铜含量的最佳前处理方法，为相关部门对茶叶中微量元素的检测提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌茶叶：市售；1 000 μg/mLFe 标准溶液、1 000 μg/mLZn 标准溶液、1 000 μg/mLCu 标准溶液：国家有色金属及电子材料分析测试中心；硝酸（电子级）：苏州晶瑞化学股份有限公司；过氧化氢（优级纯）：美国默克公司。

1.2 仪器及设备

VCD 酸蒸清洗仪：德国安东帕公司；Titan MPS 微波消解仪、PinAAcle 900T 原子吸收光谱仪：珀金埃尔默仪器有限公司；GHP400P 智能控温电热板：奥普勒公司；FA114 电子分析天平：上海豪晟科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验前准备

利用酸蒸清洗仪对试验所用的器材清洗干净，备用；超市随机购买某品牌茶叶，研磨备用。加标液的制备：分别吸取1000μg/mL 铁标准溶液10 mL，1 000 μg/mL的 Zn 标准溶液 3 mL，1 000 μg/mL 的 Cu 标准溶液4 mL 于100 mL 容量瓶中并用纯净水定容、摇匀，即得混合标准储备液，用于消解开始前对样品进行加标。

1.3.2 单因素试验

参考已发表的有关茶叶中微量元素测定的文献[12-14]，选取适宜的前处理条件进行试验。试验针对微波消解中影响消解效果的关键步骤中的各条件进行，分别称取茶叶样本0.3 g 左右，置于消化罐中，分别采用硝酸含量（2、4、6、8、10、12 mL）、温度（140、150、160、170、180、190 ℃）、消解压力（30、40、50、60、70、80 bar）和保持时间（10、15、20、25、30、35 min）对样本进行消解，通过对其中的Fe、Zn、Cu 进行检测，以加标回收率来判断硝酸消耗量、消解温度、消解压力和保持时间对消解效果的影响。

1.3.3 正交试验

根据单因素试验的结果，确定样品前处理中的硝酸含量、温度、消解压力、保持时间为4 个研究因素，根据正交试验设计中的L9（34）正交表设计试验，对样品进行微波消解，消解完成并进行赶酸处理后应用火焰原子吸收光谱仪测定消解液的分光光度值。通过铁、锌、铜的系列标准溶液绘制标准曲线，然后根据标准方程及所测得的消解液的分光光度值计算消解液中铁、锌、铜的含量。以加标回收率为评价指标，得出最佳前处理条件。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels of digestion

1.3.3.1 样品前处理

取7 个微波消解罐分别编号0 号～6 号，其中0 号为空白对照，使用电子分析天平准确称取茶叶样品0.3 g 左右，分别置于1 号～6 号微波消解罐中，按正交试验设计所设计出的条件分批逐一消解样品。量取一定体积的硝酸于7 个消解罐中，混匀，静置5 min 左右使硝酸与样品进行初步反应后，再向每个消解罐中加入 2 mL 过氧化氢，静置 5 min，然后向 2、4、6 号 3 个消解罐中加入0.5 mL 上述混合标准储备液，盖紧消解罐内盖置入微波消解仪中，按照设定程序进行消解，其中消解共分为3 个步骤，本试验采取的方法为固定步骤1 和步骤3，对影响消解效果的关键步骤（步骤2）进行试验条件的调整，表中步骤2 中待定程序按表1 设定。消解程序完成后，取出消解罐将消解液移入烧杯中，并用纯净水清洗消解罐内盖及消解罐3 次～4 次一并倒入烧杯中，赶酸后，将其多次洗涤并转移至50 mL容量瓶中，并用纯净水定容，摇匀，即得样本液，待测。微波消解的升温程序见表2。

表2 微波消解升温程序Table 2 The heating process of microwave digestion system

1.3.3.2 仪器工作条件

本次试验的原子吸收光谱工作条件见表3。

表3 仪器工作条件Table 3 Working coitions of atomic absorption spectrometry

1.3.3.3 标准溶液的制备

取铁、锌、铜的标准溶液配置一系列标准溶液。取1 000 μg/mL 的铁标准溶液稀释至50 mg/L，分别取1、2、3、4、5 mL 于 100 mL 容量瓶中并用纯净水定容，得到铁的系列标准溶液。取1 000 μg/mL Zn 标准溶液稀释至 25 mg/L，分别取 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mL 于 100 mL 容量瓶中并定容，得到锌的系列标准溶液。取1 000 μg/mL的铜标准溶液稀释至 25 mg/L，分别取 0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mL 于100 mL 容量瓶中并用纯净水定容，得到铜的系列标准溶液。

1.3.3.4 测定元素含量

以纯净水作为试剂空白与标准空白，使用火焰原子吸收光谱仪测定上述系列标准溶液和待测样液的吸光度值。根据所得的标准曲线及标准方程，求得待测样液中铁、锌、铜的含量。

1.4 数据处理

本次试验数据录入EXCEL13.0 中，运用公式计算得出均数和极差。

2 结果与分析

2.1 标准方程及相关系数

原子吸收光谱仪按照表3 条件下工作，测定标准溶液，最终测得Fe、Zn 和Cu 的标准方程分别为y=0.084 90x+0.000 65（r2=0.999 5）、y=0.685 89x+0.000 42（r2=0.999 8）和 y=0.198 5x+0.001 1（r2=0.999 8）。由此可知微量元素Fe、Zn、Cu 的线性关系及相关性较好。

2.2 单因素试验结果

单因素试验结果表明，就硝酸的消耗量来看，Fe，Zn 和Cu 的加标回收率最好的硝酸消耗量分别是6、6、8 mL。就温度的影响来看，Fe，Zn 和 Cu 的加标回收率分别在190、190、180 ℃为最高。就消解压力的影响来看，Fe，Zn 和 Cu 的加标回收率分别在 50、60、60 bar时最高。就保持时间的影响来看，Fe，Zn 和Cu 的加标回收率均在20 min 时最高。

2.3 正交试验结果

以加标回收率作为评价指标，所得正交试验检测结果见表4。

在表4 中，Ki代表任何一列水平号为 i（i=1，2，3）时所对应的回收率均数之和，K1、K2、K3则表示任何一列水平号为i（i=1，2，3）时所对应的平均回收率均数；极差R 表示任何一列中K1、K2、K3中的最大值和最小值的差值。因为极差R 的值越大，则对应的因素影响力越大，通过极差分析结果可知：对于微量元素铁而言，影响微波消解效果的因素依次为硝酸含量、消解压力、保持时间和温度；对于微量元素锌来说，微波消解过程中保持时间是最重要的因素，其次为温度，然后是硝酸含量，最后是消解压力。Ki值的大小表示所选择的每个因素的3 个不同水平对试验结果的影响力大小，其值越大，则影响力越大。因此，对于微量元素铁，微波消解的最佳组合方案为A2B3C2D2，即硝酸含量6 mL、温度 190 ℃、消解压力 50 bar、保持时间 20 min；对于微量元素锌，其最优前处理条件为：A3B3C2D3，即为硝酸含量8 mL，温度190 ℃，消解压力50 bar，保持时间25 min。对于铜，影响微波消解效果的因素顺序是温度、保持时间、硝酸含量以及消解压力，其微波消解优化组合是A3B2C3D1，即：硝酸含量8 mL，温度170 ℃，压力60 bar，和保持时间15 min。

2.4 验证试验

准确称取茶叶样本0.300 0 g，共6 份，在本试验所得的3 种元素的最佳前处理条件下进行验证试验，分别得到 Fe、Zn、Cu 的加标回收率平均为 99.73 %，98.91%和100.02%，与赵永福[4]的结果比较，回收率和精密度均较优，说明本文的结果方法可取。

2.5 精密度与检出限测定

Fe、Zn、Cu 精密度测试时分别选择浓度为 1.5、0.45、0.8 mg/L 的标准溶液，分别连续测定7 次即可得出该元素的精密度。测试结果显示：Fe、Zn、Cu 的相对标准偏差分别时0.25%、0.11%和0.2%。检出限测试时使用试剂空白连续测定11 次即得。结果显示：Fe、Zn、Cu 的检出限分别为0.014 1、0.001 3、0.0030 2 mg/L。3种元素的相对标准偏差和检出限均在仪器允许的误差范围之内，说明火焰原子吸收光谱仪在该工作条件下，检测的准确可靠性高，重复性好，精密度也较高。

3 结论与讨论

预试验阶段，在样本的前处理准备时，消化液的加入量和加入速度需要特别注意。由于本次试验所用的样本为茶叶，研磨后为一种轻质粉末，在加入双氧水和硝酸后，会因为反应而产生类似沸腾的现象，样本反应太迅速，导致产生的气体带着样本液体直接溢出消解罐，影响消解效果。此现象可以通过增加硝酸和双氧水加入的时间间隔来解决，本次试验，我们使用的时间间隔为2 min，有效的避免了样本损失。

陈文生等[15]在用正交试验法测定茶叶中的微量元素时得出结果表明：对于元素钙，其影响因素依次为消解液的体积比（HNO3/H2O2）、消解时间、消解液的用量，最佳前处理方案是HNO3/H2O2的体积比为2 ∶1，消解时间为105 min，消解液用量10 mL。赵欣等[16]通过对陈醋中的几种微量元素的同时进行正交试验分析，以寻求最佳前处理方法。本试验通过正交试验设计，得到影响微量元素铁的因素从高到低依次为硝酸含量、消解压力、保持时间和温度，其微波消解的最佳组合方案为硝酸含量6 mL，温度190 ℃，消解压力50 bar，保持时间20 min；对于微量元素锌来说，微波消解过程中保持时间是最重要的因素，其次为温度，然后是硝酸含量，最后是消解压力，其最优消解条件为硝酸含量8 mL、温度 190 ℃、消解压力 50 bar、保持时间 25 min；影响Cu 微波消解效果的因素顺序是温度、保持时间、硝酸含量以及消解压力，最佳前处理条件组合是为硝酸含量8 mL，温度170 ℃，消解压力60 bar，和保持时间15 min。经过优化后的微波消解法较之传统的试验条件的选择和更换来说，具有消解迅速、彻底、准确度高、精密度好高效、污染环境小等特点，适宜在试验条件的优化中推广应用。

本试验通过使用正交试验设计优化后的前处理条件进行微波消解，减少试验次数，提高试验效率，增加了试验准确性，在今后的研究中，可考虑多种方法的联合使用[17-18]，以增强试验的效率。本次试验所用的各种前处理方法条件，均能将样本有效的消解，花费时间短，消耗的试剂少，适用于所有茶叶中Fe、Zn、Cu含量的测定，所得出的结果可为有关检测部门对茶叶的测定提供参考依据，具有比较重要的实践意义。