致奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及防治建议

（四川农业大学动物医学院，成都 611130）

奶牛乳房炎是导致奶牛场经济损失的主要因素之一，全球每年因乳房炎造成的损失高达几十亿美元，我国奶牛养殖业起步较晚，在这方面的损失更是巨大[1,2]。引起奶牛乳房炎的病因是纷繁复杂的，目前将造成该病的原因主要分为物理性因素、病原性因素和环境性因素三类，其中病原性因素占主要方面，也是造成该病长期存在和难以治愈的主要影响因素[3]。病原性因素又以细菌为主，根据其来源和传播方式的差异，这些病原体可分为接触传染性病原体和环境性病原体两大类[4]。肺炎克雷伯氏菌则为典型的环境性致病菌，可直接、间接地经口感染或者经乳头感染，引起奶牛呼吸道或乳房炎疾病（图1）[5]。本文将对肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定并对防治措施进行阐述，以供牧场能更好地防控由该菌引起的乳房炎。

图1 克雷伯氏菌在奶牛场的传播示意图[5]

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

从四川省资阳市、邛崃市、成都市青白江区的3个规模化牧场，分别采集临床型乳房炎奶样各10份，用于肺炎克雷伯氏菌的分离培养。

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、LB肉汤、MH琼脂培养基，购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌DNA提取试剂盒，购于天根生化科技（北京）有限公司；DL-2000 Marker，2×Taq PCR Master Mix，购于成都擎科生物技术有限公司；生化试验发酵管、药敏纸片，购于杭州微生物试剂有限公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器设备

高压蒸汽灭菌锅（上海H申医疗核子仪器厂），恒温培养箱（Thermo公司），恒温水浴锅（常州朗越仪器制造厂），超净工作台（苏州净化设备有限公司），高速离心机（Eppendorf公司），PCR扩增仪（Bio-RAD），电泳仪（北京六一生物科技有限公司），全自动凝胶成像仪（Bio-RAD），1～1000µL移液枪（Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离培养

无菌采集临床型乳房炎乳样，做好标记放入低温采样箱送至实验室，在超净工作台用无菌棉签接种至已配制好的TSA培养基上，恒温培养箱培养18～24h，挑取疑似菌落做革兰氏染色镜检，并进一步纯化、扩大培养。

1.3.2 细菌生化鉴定

对疑似细菌做葡萄糖、麦芽糖、木糖、山梨醇的生化管发酵，并做苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸水解酶、鸟氨酸脱羧酶、氧化酶试验，依照《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《伯杰细菌鉴定手册》[7]进行生化结果判定。

1.3.3 细菌16S rDNA鉴定

挑取疑似为克雷伯氏菌的菌落至1 5 m L离心管中，振荡过夜培养，取1.5 m L在灭菌的离心管中，按照细菌D N A提取试剂盒提取步骤，提纯细菌D N A，并作1 6 S r D N A扩增。引物序列为F：A G A G T T T G A T C C T G G C T C A；R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

反应体系(25µL)：上、下游引物各0.5µL，细菌基因组1µL，2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，ddH2O 补足体系。反应条件：95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 45s，34个循环；72℃ 7min。预期扩增片段1500bp，将阳性扩增样品送至华大基因有限公司测序，并在NCBI在线BLAST比对测序结果，下载同源性较高序列采用MEGA 6.0 软件建立进化树，进行同源性分析。

1.3.4 细菌药敏试验

挑取已分离鉴定的克雷伯氏菌于15mL离心管中，在恒温振荡仪过夜培养，于次日取出调整至0.5麦氏浊度，并按照CLSI推荐的琼脂扩散法（K-B）进行药物敏感试验。

2 结果

2.1 细菌分离培养

在培养18～24h后，TSA平板上长出直径为5～6mm、圆而饱满、白色或乳白色菌落，用接种环挑取易拉成丝。革兰氏染色后在油镜下可观察到短粗的革兰氏阴性菌（图2）。本次共分离到三株疑似克雷伯氏菌，分别命名为KP1、KP2、KP3。

图2 分离菌的菌落形态（a）及革兰氏染色形态（b）

2.2 分离菌株的生化特点

生化试验发现，菌株KP1、KP2、KP3均能发酵葡萄糖、麦芽糖、木糖、山梨醇，苯丙氨酸脱氨酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、精氨酸水解酶试验、M-R试验、VP试验均为阴性，该试验结果符合克雷伯氏菌特点。

2.3 16S rDNA鉴定及进化树分析

根据16S rDNA预期设计扩增出了1500bp大小目的片段（图3），在NCBI在线BLAST比对结果显示，三株分离菌均与肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）相似度为99.99%。系统发育进化树显示（图4），分离菌株KP1、KP3与CP031810株、CP031562株、CP032185株亲缘关系较近，分离株KP2则相对较远。

图3 16S rDNA结果

图4 16S rRNA 基因系统进化分析树

2.4 分离菌株药敏试验

药敏试验结果显示，3株分离菌株均对阿莫西林、头孢他啶、头孢曲松耐药，对链霉素、庆大霉素表现敏感，分离菌株KP1和KP3对青霉素表现中度敏感，菌株KP2则表现耐药，具体结果见表1。

表1 分离菌株药敏试验结果

3 肺炎克雷伯氏菌的防治

3.1 发病特点

肺炎克雷伯氏菌为条件性致病菌，在粪便、垫料和土壤中均存在，该菌的传播主要发生在挤奶间隔，当乳头接触到被污染的设备或物品时，极有可能会引发乳房炎[8,9]。该菌在夏季的感染率要显著高于其他季节，一般感染后患牛会突然出现体温升高、产乳量下降、食欲减低和脱水症状，重者则会出现起卧困难甚至无法站立，牛奶呈现水样或血奶[10,11]。

3.2 治疗

当前大多数牧场在治疗奶牛乳房炎时选用的药物为β-内酰胺类乳房灌注剂，如阿莫西林、头孢喹肟等，这类广谱抗生素虽然对治疗部分乳房炎有效果，但长期使用已经出现了不同程度的耐药。根据本研究的药敏结果，针对该菌的治疗应该首选氨基糖苷类药物，如庆大霉素等，可以取得良好的临床效果。

3.3 防控

针对该菌的防控，和大多数条件性致病菌一样，首先应该是保证牛舍饲养环境的干燥、洁净，良好的躺卧环境是预防疾病的基础；再者就是要选择合适的药浴液，坚持前药浴和后药浴可以有效地减少和阻止病原微生物的入侵；最后要注意的一个点就是饲喂营养，不仅要满足奶牛的日常营养需求，而且要使奶牛保持良好的抵抗力[12,13]。

4 小结

经对牧场30份乳样进行培养，成功分离了3株肺炎克雷伯氏菌。从该菌的药敏结果来看，3株分离菌株均对阿莫西林、头孢他啶、头孢曲松耐药，对链霉素、庆大霉素表现敏感，分离菌株KP1和KP3对青霉素表现中度敏感，菌株KP2则表现耐药，故针对该菌的治疗应该首选氨基糖苷类药物。由肺炎克雷伯氏菌引起的奶牛乳房炎多在夏季发生，南方地区奶牛在夏季多出现热应激，再加上气候潮湿，无疑为该菌的防控增加了难度，牧场应该在保证营养状况良好的情况下，尽可能地减少卧床、圈舍的污染，保证挤奶前、后的药浴。