白及蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

蒋素华　牛苏燕　周一冉　崔波　梁芳　袁秀云　马杰

摘要：  為揭示白及蔗糖合成酶基因与生长发育的关系，该研究以白及为材料，利用RT-PCR技术同源克隆白及蔗糖合成酶的关键基因SuSy，对SuSy基因的生物学特性及表达特征进行了分析，并利用实时荧光定量PCR检测SuSy基因在不同组织中的表达规律。结果表明：（1）白及SuSy基因长度为2 215 bp，编码737个氨基酸，与铁皮石斛、文心兰和蝴蝶兰的蛋白质氨基酸序列的相似性分别为97%、92%和95%。（2）生物信息学分析表明，SuSy蛋白质序列具有较高的亲水性，与拟南芥SuSy蛋白质氨基酸三级结构一致性为75.2%;系统进化树分析发现，白及SuSy蛋白与铁皮石斛处于同一个分支上。（3）qRT-PCR结果表明，SuSy基因在叶片中的表达量最高，块茎中的表达量最低;成熟叶片的表达量高于未成熟叶片的表达量;数据差异性分析显示，SuSy基因在根、块茎中表达量具有极显著性差异，但在一年生叶和二年生叶中的表达量无显著性差异，幼苗叶和一、二年生叶中表达量具有极显著性差异。由此推测，SuSy基因可能受生长发育的诱导，是调控白及生长发育关键基因。

关键词： 白及， SuSy基因， 生物信息学分析， 表达分析

中图分类号：  Q786文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2020）02-0192-08

Abstract：  To reveal the function of sucrose synthase （SuSy） gene during the growth and development in Bletilla striata species， the SuSy gene was cloned and its biological and expression characteristics were analyzed. In this study， a key gene （SuSy） for sucrose biosynthesis was homologously cloned from B. striata by RT-PCR technology. Bioinformatics analysis of SuSy gene was performed and real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression pattern of SuSy gene in different tissues. The results were as follows： （1） The length of SuSy gene was 2 215 bp that encoding 737 amino acids. The similarity of the protein amino acid sequence in Bletilla striata to Dendrobium officinaleis， D. oncidium， and D. phalaenopsis were 97%， 92% and 95%， respectively. （2） The results of bioinformatics analysis showed that the SuSy protein sequence was high hydrophily， and the consistency of amino acid tertiary structure of SuSy protein between the Bletilla striata and Arabidopsis thaliana was 75.2%. Phylogenetic tree analysis suggested that the SuSy protein of Bletilla striata and Dendrobium candidum were grouped in the same branch. （3） The qRT-PCR assay showed that the expression level of SuSy gene was the highest in leaves and lowest in tubers. Moreover， the expression of SuSy gene in mature leaves was higher than that in immature leaves. According to the statistical analysis， the expression level of SuSy gene in roots and tubers were very significant， but there were no significant difference in the expression of one-year leaves and two-year leaves， and the expression of seedling leaves were extremely significant.  These findings suggested that SuSy gene may be induced by growth and development， and is the key gene for regulation of growth and development in Bletilla striata species.

Key words： Bletilla striata， SuSy gene， bioinformatics analysis， expression analysis

白及（Bletilla striata）是兰科（Orchidaceae）白及属（Bletilla）多年生草本植物，地下有粗厚的块茎，富粘性，含白及胶质，可供药用，有止血补肺、生肌止痛之效。蔗糖合成酶（sucrose synthase， SuSy） 在植物各组织中普遍存在（Sung et al.，1986），是高等植物体内控制蔗糖合成和降解的关键酶之一，提供多糖合成的前体，催化蔗糖进入各种代谢。蔗糖代谢相关酶与植物体内糖积累之间存在密切联系，SuSy在蔗糖代谢中起主要的调控作用，在植物的生长发育和产量调控方面都具有重要的意义（Vaughn et al.， 2002;Zhang et al.， 2011;Wang et al.， 2017）。目前研究者已经从铁皮石斛（孟衡玲等，2011）、枸杞（王丽娟等，2013）、蝴蝶兰（李冬梅等，2013）及花生（陈娜等，2013）等多种植物中将SuSy基因克隆出来。罗才林等（2017）利用转录组测序和电子克隆相结合的方法将白及SuSy基因序列进行了生物信息学分析。植物的蔗糖合成酶基因除主要参与储存组织的生长外，也参与植物的抗逆性、果实的发育及花芽的分化和发育等生命活动（乔亮， 2012;Zhang et al.， 2013; Xiao et al.， 2014）。有研究表明，SuSy基因家族不同成员在植物生长发育过程中具有时空特异性（Wang et al.， 2015;Chen et al.， 2012），以玉米 （Zea mays） 中的3个SuSy基因为例，SH-SuSy1 主要在胚乳中表达;SuSy1在胚，以及根、茎和叶中都有表达;SuSy3 在胚乳、胚珠、根和幼芽中表达（Duncan et al.， 2006）。此外，有研究表明， SuSy3在茎和根的维管组织中高表达，SuSy4 在块茎的贮藏组织中高表达（Xu et al.， 2012）。水稻（Oryza sativa） 中发现6 个SuSy基因，参与了不同的生长过程，SuSy1在根、幼叶、节间表达，SuSy3和SuSy4主要在颖果中表达，SuSy2 在所有组织中都表达（Hirose et al.， 2008）。目前关于白及SuSy基因同源克隆和表达特性分析的研究还未见报道。结合白及的生理和生长特性，采取不同时期的白及组织材料，根据NCBI上登陆的其他不同植物的SuSy基因序列，设计简并引物，采用RT-PCR方法克隆白及SuSy基因，并对其进行氨基酸序列比对，蛋白质二、三级结构预测和系统进化树分析，利用实时荧光定量PCR技术分析SuSy基因在白及的不同时期根、叶和块茎中的表达。本试验为进一步研究SuSy基因功能及代谢途径奠定理论基础，同时为白及蔗糖代谢和生长发育提供较为丰富有效的科学理论依据。

1材料与方法

1.1 试验材料

供试的白及品种为紫花白及，种植于郑州师范学院智能日光温室，白及的栽培温度为22～26 ℃，湿度为55%～65%。Escherichia coli DH5α菌株购自宝生物工程（大连）有限公司，反转录试劑盒购自上海拜力生物科技有限公司，植物RNA提取试剂盒购自广州飞扬生物工程有限公司，普通琼脂糖DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，基因测序和引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1总RNA 的提取和cDNA第一链的合成采用OMEGA HP Plant RNA Kit 植物总RNA 提取试剂盒，按照其说明要求进行RNA提取。利用反转录酶M-MLV将白及总RNA反转录成cDNA第一条链，作为白及SuSy基因克隆的模板。

1.2.2 设计简并引物根据NCBI 中已经登录的单子叶植物SuSy基因，经DNAMAN 序列比对，找出其中保守的核苷酸序列，在SuSy基因的保守区设计一对简并引物，上游引物为TTTGGGTTATCCTGACACTGGT，下游引物为TCCTGAAGGGAACCCGAAG，用于扩增目的基因。

1.2.3 PCR扩增SuSy基因保守区以逆转录获得的cDNA为模板，利用上游引物和下游引物PCR扩增白及的SuSy基因保守片段。反应体系10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP（2.5 μmol·L-1）1.6 μL，MgCl2（25 μmol·L-1）1.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U ·μL-1）0.2 μL，模板cDNA 1.0 μL，定量补足ddH2O至20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30个循环，72 ℃延伸5 min。

1.2.4 白及SuSy基因保守区的鉴定取PCR产物进行经琼脂糖凝胶电泳检测，待检测之后，将扩增产物进行T-A连接，转入大肠杆菌DH5α菌株进行测序分析。将测序结果进行Blast比对分析，验证测序结果的正确性。.

1.3 SuSy基因的生物信息学分析

基因相似性采用NCBI上的BLAST分析，氨基酸序列比对采用DNAMAN分析，蛋白质亲疏水性采用ProtScale分析，亚细胞定位采用PSORT Ⅱ软件分析，蛋白质二级结构预测采用ExPASy网站上的GOR分析，系统进化树采用MEGA6.0分析，蛋白质三级结构预测采用ExPASy网站上的SWISS-MODEL 分析。

1.4 SuSy基因的表达分析

根据SuSy基因序列设计出特异性较强的qRT-PCR引物，参照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ使用说明，用qRT-PCR（Real-time quantitative PCR）的方法检测SuSy基因在白及不同生长阶段不同组织的表达量，白及EF1α基因作为内参基因（GenBank登录号：MK448293）。SuSy基因qRT-PCR上游引物为TTTGGGTTATCCTGACACTGGT，下游引物为TCCTGAAGGGAACCCGAAG。EF1α内参基因上游引物为GCCGTCCTTATTATTGATTCCA，下游引物为GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA。反应体系共20.0 μL：2×SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，灭菌蒸馏水6.4 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，共41个循环。qRT-PCR结果按照公式Rel. Exp = 2-ΔΔCt计算该基因的相对表达量。式中：ΔCt=Ct（SuSy）-Ct（EF1a RNA）;ΔΔ Ct=（各植物组织ΔCt）-（一年生块茎ΔCt）。数据差异性采用SPSS 17.0（SPSS Inc.， Chicago， USA）软件进行单因素方差分析。

2结果与分析

2.1 白及RNA提取

由电泳结果可知，白及叶片总RNA有完整的28S、18S和5S条带（图1），表明提取的总RNA完整性较好，很少出现降解现象，OD260/280的值为2.12，浓度为110.23 ng·μL-1。

2.2 SuSy基因的克隆

以白及叶片总RNA反转录cDNA为模板，以简并引物对保守区片段进行RT-PCR扩增，得到1个2 215 bp保守片段，编码737个氨基酸，连接到pGEM-T Easy载体上测序验证，得到的阳性质粒命名为pGEM-SuSy（图2）。

2.3 SuSy蛋白亲疏水性分析

利用 ProtScale在线分析软件分析显示，SuSy蛋白质序列具有较高的亲水性，其中第563位氨基酸的亲水性最强（2.478），第412位氨基酸的疏水性最强（-2.767）。整体来看，亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，且多于疏水性氨基酸，因此整个多肽链表现为亲水性，可认为该酶是亲水性蛋白（图3）。

2.4 SuSy蛋白质二级结构和三级结构预测

采用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测，结果表明，白及SuSy由39.35%的 α-螺旋（alpha helix）、14.93%的延伸链（extended strand）、45.73%的无规则卷曲（random coil）组成（图4）。图 2SuSy基因PCR扩增利用SWISS-MODEL软件分析SuSy氨基酸三级结构，以（3s27.1.A）为模板进行建模，该模板以X-RAY 2.90 方法产生，结果显示，白及SuSy与拟南芥SuSy蛋白三级结构一致性为75.2%（图5）。

2.5 SuSy氨基酸序列同源性分析

利用BlastP对SuSy蛋白进行序列同源比对分析，发现白及SuSy在氨基酸水平上与兰科植物的SuSy蛋白具高度相似性，白及SuSy的氨基酸序列与铁皮石斛、文心兰、蝴蝶兰的相似性分别为97%、92%、95%（图6）。进一步利用MEGA6.0软件，采用相邻连接法构建系统进化树，根据SuSy氨图 5SuSy蛋白的三级结构预测基酸序列进行亲缘关系分析（图7），结果显示，白及SuSy与铁皮石斛（XP_020697542）处于同一个分支上，和蝴蝶兰（XP_020583263）的SuSy亲缘关系也较近。A、B、C分别代表根、叶和块茎的不同时期的表达量;a、b、c代表显著性差异（P<0.001）。

2.6 SuSy基因的表达分析

本试验根据Real-time PCR的扩增数据，得到SuSy基因各个样品相对于内参的表达量。将所得数据通过SPSS 17.0（SPSS Inc.， Chicago， USA）软件进行单因素方差分析，SuSy基因在白及的不同组织中均有表达，但有不同的表达水平，SuSy基因在根（P<0.001）、块茎（P<0.001）中表达量具有极显著性差异，但在一年生叶和二年生叶（P>0.05）中的表达量无显著性差异，幼苗叶和一、二年生叶（P<0.001）中表达量具有极显著性差异。结果显示，白及幼苗期，根和叶中都有SuSy基因的表达，叶中SuSy基因的表达量高于根;在白及一年生苗中，根、叶和块茎中都有SuSy基因表达，叶中SuSy基因的表达量高于根和块茎;在白及二年生苗中，叶中SuSy基因的表达量也最高，根中次之，块茎中的SuSy基因表达量最少;白及一年生苗块茎的SuSy基因的表达量高于二年生块茎的SuSy基因的表达量。在白及叶中成熟叶片的SuSy基因表达量高于未成熟叶片的表达量（图8）。

3讨论与结论

蔗糖是植物体内主要的运输物质和暂贮物质，蔗糖的合成速率与运输对植物生长发育及碳水化合物贮藏器官的生物产量影响很大（Klotz & Haagenson， 2008;Persia et al.， 2008;Chen et al.， 2012）。因此，SuSy活性的高低直接影響多糖的含量及生物产量。本试验利用同源克隆技术成功克隆了白及SuSy基因序列，该基因长为2 215 bp，编码737个氨基酸。生物信息学分析结果显示，SuSy蛋白质二级结构预测结果表明，α螺旋占39.35%，延伸链占14.93%，无规则卷曲占45.73%。SuSy蛋白质三级结构预测结果显示，SuSy蛋白质三级结构与拟南芥的一致性为75.2%。白及SuSy的氨基酸序列与铁皮石斛、文心兰、蝴蝶兰的相似性分别为97%、92%、95%，说明本试验克隆的SuSy基因可能为兰科植物SuSy的同源基因。

qRT-PCR结果显示SuSy基因的表达没有组织特异性，在白及幼苗、一年生苗和二年生苗的叶、根和块茎中都有表达，该结果与烟草Ntab0259170和Ntab0259180在叶片发育的整个时期均表达的结论一致（Wang et al.， 2015）。SuSy基因在白及叶中的表达具有时间特异性，成熟叶片的表达量高于未成熟叶片的表达量，与柑橘中CitSus5和CitSus6基因主要在果汁囊和成熟叶片中表达的结果一致（Islam et al.， 2014）。陈娜等（2013）以花生为试验材料，通过荧光定量PCR分析了SuSy基因在花生各组织中的表达，结果表明，该基因为组成型表达基因，在叶和根中表达量较高，在花中表达量最低，与白及SuSy基因在叶和根的表达量较高，在块茎的表达量较低的结果具有一致性。王俊刚等（2017）研究表明甘蔗的SuSy基因差异表达具有时空表达特性，与该试验的白及叶片中的表达具有时间特异性的结果一致。胡萝卜（Daucus carota） 中目前发现有2个SuSy 基因，其中一个在花中特异性表达，另一个在茎、根、花以及成熟的种子中都有表达（Duncan et al.， 2007）。甜菜（Beta vulgaris） 中的2个SuSy基因在根中都大量表达，而在叶中表达量低（Subbaiah et al.， 2006）。甘蔗（Saccharum officinarum ） 中，目前有2个SuSy基因被确定它们的表达水平在节间的不同部位及不同的发育时期有着显著不同 （Cai et al.， 2011），该研究中白及SuSy基因在营养组织中都有表达，在叶中表达量最高，一年生块茎中的表达量较高。以上研究说明不同植物中不同类型 SuSy 基因的表达具有发育特异性，功能也有特异性。该研究表明SuSy基因可能是影响白及生长发育的主要基因，受生长发育的诱导，可以根据SuSy基因的表达特性指导白及的栽培种植及药材采收时间。

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（责任编辑 何永艳）