枳实药材HPLC-DAD/ESI-TOF-MS的定性鉴别

黄雪丽，陈玉宇，王丽平，孔秀芹

(泰州医药高新技术产业园区管理委员会公共平台服务中心，江苏 泰州 225300)

枳实为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种或甜橙(CitrussinensisOsbeck.)的干燥幼果。枳实味苦、辛、酸，微寒。具有破气消积，化痰除痞之功效[1]。可用于积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹，结胸，脏器下垂等。为血分中之气药，惟此称最。

枳实的化学成分主要为生物碱和黄酮类两类物质。据现有文献报道的枳实的化学成分分析方法有HPLC和HPLC-MS联用等。由于生物碱类和黄酮类等对照品难于获得，所以在无法获得对照品的情况下，利用相对保留值进行定位显得必要。本实验首次采用HPLC-DAD/ESI-TOF-MS技术对枳实中的生物碱类和黄酮类成分进行快速分析，根据高分辨质谱获得的母离子信息，结合对照品以及参考文献[2-14]，对枳实中多种化学成分进行了鉴定，为该药材的GAP提供参考。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪配PDA检测器，美国Agilent；Agilent 6224 TOF-LC-MS系统，配备ESI源；Agilent Mass Hutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站；AnkeTGL-16B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ 3200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；AB135-S分析天平，美国梅特勒-托利多仪器有限公司；高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司。

枳实炮制品分别购自河南宛西制药、河南省弘景中药饮片、四川科伦天然药业、江西樟树天齐堂中药饮片、亳州市永刚饮片等公司，经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种或甜橙(CitrussinensisOsbeck.)的干燥幼果，样本现保存于中国药科大学药学院。枳实炮制品如表1所示。

对照品：柚皮苷(批号：12030612)，成都曼斯特生物科技有限公司；橙皮苷(批号：12020304)，成都曼斯特生物科技有限公司；新橙皮苷(批号：12030701)，成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均≥98%。

试剂：甲醇(特级纯)，江苏汉邦科技有限公司；乙酸(分析纯)，南京化学试剂有限公司；乙醇(分析纯)，江苏强盛功能化学股份有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

表1 不同产地及不同炮制品的枳实Table 1 Fructus aurantii from different producing areas and processed products

2 方 法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备

分别取9份不同编号枳实药材样品适量，高速多功能粉碎机粉碎，60 ℃烘干。分别称取枳实药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，放置超声波清洗器超声提取30 min，放冷，过滤，滤液置50 mL量瓶中，滤渣重复提取1次，合并滤液，定容。提取液于高速离心机16000 r·min-1离心10 min，取上清，进样。

2.1.2 对照品溶液的制备

分别精密称量新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷对照品适量，甲醇溶解配成浓度约1 mg·mL-1的储备液，分别稀释制得含新橙皮苷203.00 μg·mL-1、橙皮苷130.75 μg·mL-1、柚皮苷326.75 μg·mL-1的混合对照品储备液。-20 ℃保存，备用。

2.2 色谱条件

汉邦Phecda C18色谱柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为2%乙酸水溶液(A)-甲醇(B)；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL；梯度洗脱程序，总洗脱时间为75 min。

梯度洗脱条件为：0～10 min (5%～15%B)，10～15 min (15%～20%B)，15～20 min (20%～30%B)，20～25 min (30%～36%B)，25～40 min (36%B)，40～45 min (36%～65%B)，45～50 min (65%～80%B)，50～55 min (80%～95%B)，55～60 min (95%B)，60～65 min (95%～5%B)，65～75 min (5%B)。

2.3 质谱条件

电喷雾(ESI)离子源；采用分别正离子和负离子模式检测；毛细管电压3.5 kV；TOF检测电压120 V；捕捉电压65 V；脱气溶剂气流量8 L·min-1；脱气溶剂温度350 ℃；雾化室压力：30 Psig；每1 s采集一次图谱；全扫描(MS scan)，质量扫描范围：100～1000 m/z；实验数据采用Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站软件处理。

3 结 果

3.1 HPLC-ESI/DAD-TOF-MS成分鉴定

采用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS对枳实提取液中化学成分进行定性分析，对照品图谱见图1，枳实的ESI(+)/DAD-TOF-MS和ESI(-)/DAD-TOF-MS的质谱总离子流图见图2和图3。

图1 对照品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the reference

图2 枳实(样品1)总提取物的正离子模式总离子流图Fig.2 Mass spectrometry total ion chromatogram (TIC) of Positive ion mode of total extract of Fructus Aurantii Immaturus

图3 枳实总提取物负离子模式总离子流图Fig.3 Mass spectrometry total ion chromatogram (TIC) of negative ion mode of total extract of Fructus Aurantii Immaturus

3.2 枳实化学成分分析

通过HPLC-ESI/DAD-TOF-MS检测得到枳实中各化学成分的保留时间和质谱信息，并结合提取离子流图及与对照品、相关文献数据对比，从而对枳实进行化学成分确认，样品1中分析鉴定的成分见表2。

表2 枳实提取物的HPLC-ESI/DAD-TOF-MS数据及成分鉴定Table 2 Identification results of Fructus Aurantii Immaturus by HPLC-ESI/DAD-TOF-MS

3.3 枳实化学成分的定性鉴别

枳实药材的总离子流色谱图中，保留时间为39.886 min，43.696 min处出现2个色谱峰，它们具有相同的相对分子质量，但具有不同的保留行为，其提取离子色谱图见图1。其中，通过与对照品比对，确定保留时间为39.886 min的色谱峰为新橙皮苷，43.696 min的色谱峰为橙皮苷。

其中tR为34.833 min的峰在ESI+，ESI-模式下分别得到m/z为581，579的离子峰，其保留时间及质谱行为与柚皮苷对照品相一致，据此确定该化合物为柚皮苷。tR为39.886 min的峰在ESI+，ESI-模式下分别得到m/z为611，609 的离子峰，其保留时间及质谱行为与新橙皮苷对照品相一致，据此确定该化合物为新橙皮苷。tR为43.696 min的峰在ESI+，ESI-模式下分别得到m/z为611，609的离子峰，其保留时间及质谱行为与橙皮苷对照品相一致，据此确定该化合物为橙皮苷。

tR为2.116 min和51.383 min，它们具有相同的分子量，可能是酸橙素/异橙黄酮/桔皮晶/苦橙丁这四种物质之一，还有待进一步鉴别。

同理，tR为20.968 min，它们具有相同的相对分子质量，可能是Acrimarine C或Acrimarine E，Acrimarine C/Acrimarine E这两种物质是同分异构体，需做进一步鉴别。

tR为25.772 min，相对分子质量为594.1585，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H30O15，可知是忍冬苷或忍冬苦苷。

tR为28.886 min，相对分子质量596.1736，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H32O15，可知是圣草次苷/新北美圣草苷，可进一步做定性鉴别，判断属于哪种物质。

tR为48.004 min，相对分子质量为594.1964，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C28H34O14，可知是枸橘柑或异樱花素-7-芸香糖苷，可进一步做定性鉴别，判断属于哪种物质。

同时根据已报道的文献[2-7]，将各物质出峰的先后顺序、ESI+，ESI-模式下分别得到m/z 等与文献中的信息相比对，可以推测tR为6.589 min 的色谱峰为迷迭香素；tR为26.014 min 的色谱峰为6,7-二羟基香豆素；tR为37.534 min的色谱峰为柚皮素；tR为46.280 min的色谱峰为野漆树苷；tR为46.380 min的色谱峰为Acrimarine B；tR为47.109 min的色谱峰为花椒毒酚；tR为47.987 min的色谱峰为柠檬苦素；tR为48.086 min的色谱峰为槲皮素-3-O-葡萄糖苷；tR为48.665 min的色谱峰为橙皮素；tR为50.289 min的色谱峰为马曼；tR为50.787 min的色谱峰为去甲肾上腺素；tR为52.277 min的色谱峰为3′,4′,7,8-四甲氧基黄酮；tR为54.696 min的色谱峰为单羟基五甲氧基黄酮；tR为54.845 min的色谱峰为异樱花素；tR为56.303 min的色谱峰为芹菜素。

从九个样品定性分析结果中可以看出，不同产地不同炮制品中同种物质的成分含量有显著的差别；且同种产地中不同炮制品种不仅成分种类有差别，而且的含量也有差别，所以造成了临床用药的不科学性，以及临床疗效的差别，因此加强中药的临床用药规范尤为重要。

4 讨 论

4.1 柱温的选择

本实验考察了不同温度下，色谱的分离情况。在25 ℃、30 ℃、35 ℃的柱温条件下的色谱分离情况，如图4所示。柱温越高，物质出峰时间越短。当柱温为25 ℃时，分离度较差，目标峰(1-柚皮苷；2-橙皮苷；3-新橙皮苷)与后面物质的峰拥挤到一起，没有达到良好的分离效果；当柱温为30 ℃和35 ℃时，对分离影响不大且升高柱温不利于柱子的保护。结果显示在30 ℃下，各成分分离良好，达到定量测定要求，故选择30 ℃为色谱分析温度。

图4 柱温的选择Fig.4 Optimization of column temperature

4.2 流动相的选择

图5 流动相中水相——甲酸和乙酸的优化Fig.5 Optimization of the aqueous phase in the mobile phase (formic acid and acetic acid)

图6 流动相中水相——乙酸百分数的优化Fig.6 Optimization of the aqueous phase in the mobile phase (the percentage of acetic acid)

本文考察了不同浓度(0.05%、0.1%、1%、2%)的乙酸溶液和甲酸(0.05%、0.1%、1%)溶液，实验结果表明，在2%HAC水溶液下，分离效果最佳，故本实验采用2%HAC为流动相，如图5和图6所示。

4.3 枳实成分结果分析

枳实药材中的主要化学成分主要有2类：生物碱类和黄酮类，它们在正离子模式下容易形成[M]+和[M+H]+母离子峰，且还有的形成[M+Na]+和[M+K]+峰；在负离子模式下容易形成[M]+和[M-H]-母离子峰，且还易形成[M-Cl]-和[M-CH3COOH]-峰。

从HPLC-ESI/DAD-TOF-MS正、负离子模式图中能看出，黄酮类物质虽然在正离子条件下也有响应，但是负离子模式下更容易形成，信号较强。黄酮类物质在负离子条件下有稳定的苯酚离子形成，而在正离子条件下，噪音的水平相对来说比较高，且有些片断在正离子模式下消失不见。这是由于黄酮类物质不能容纳氮原子，在液相中呈现低碱性，因而在正离子模式下，黄酮类的阳离子片断信号相对较弱。而生物碱类在正离子模式下产生较丰富的信息。所以对黄酮类物质进行分析时，可采用负离子模式，而生物碱类物质可以采用正离子模式。

5 结 论

本研究利用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS分析了中药枳实中的多种生物碱和黄酮类成分。根据高分辨质谱获得的精确分子量信息，依据已有文献，在缺乏对照品确认的情况下快速、准确地分析化学成分。采用正、负离子监测模式的质谱扫描功能，通过高分辨数据共鉴定了25个成分，包括黄酮苷元类、黄酮氧苷类、生物碱等成分。本实验建立了一种色谱-质谱联用的方法，同时鉴别了多种黄酮类和生物碱以及其对应的异构体，这有助于枳实的后续化学成分及其药效物质基础的研究。