lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜组织中的表达及意义

周晴 谢玉秀 樊秀婷

新生血管性青光眼是继发性青光眼的一种形式，也是重要的糖尿病视网膜病变，其病理特征为在虹膜和(或)前房角处有新血管形成[1-3]。研究表明，新血管形成随后的炎性反应是糖尿病新生血管性青光眼的特征，并可导致玻璃体出血或牵拉性视网膜脱离[4，5]。在患有糖尿病新生血管性青光眼中鉴定了各种炎性因子，如前列腺素F2(prostaglandin F2,PGF2)炎性细胞因子LTC4等。长非编码RNA(Long noncoding RNAs，LncRNA)被认为是长度超过200个核苷酸的转录物，并且在结构上与没有蛋白质编码功能的mRNA相似[6，7]。 LncRNA参与多种生物过程，如细胞凋亡，染色体印记和表观遗传调控。转移相关的肺腺癌转录物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一种lncRNA，据报道，在糖尿病视网膜病变的小鼠和RF/6A细胞模型以及糖尿病患者的房水和纤维血管膜中，其表达明显上调[8]。lncRNA MALAT1还可通过活化p38MAPK，ERK和c-Jun N末端激酶(JNK)的应激激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)激活一系列炎性反应因子。研究发现白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-6(interleukin-2，IL-6)、超敏C-反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能由lncRNA MALAT1调控[9]。本研究拟探讨lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜组织中的表达及意义，为糖尿病新生血管性青光眼的治疗提供理论及临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年6月至2018年11月在我院眼科确诊的在糖尿病新生血管性青光眼患者92例作为病例组，所有患者散瞳后检查眼底，做荧光素钠眼底血管造影(术前因晶状体混浊看不清眼底的患者，于术后 l 周进行眼底检查)。同期选择本院虹膜无新生血管的慢性闭角型青光眼患者92例为对照组，对照组无糖尿病并且通过75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)进行测试。对照组、病例组组别间基础资料见表1。本研究根据赫尔辛基宣言的原则进行，并获得本院伦理审查委员会的批准。在解释研究目的和程序后，所有患者签署知情同意书。本研究排除6个月内接受了眼部手术的患者，同时全身重大疾病患者也被排除在外。2组在性别比、年龄、吸烟、饮酒分布及BMI、收缩压、舒张压的水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同组别间基础资料的比较 n=92

1.2 虹膜组织的获取 病例组及对照组在行小梁切除术行虹膜根切时留取虹膜组织。立刻置于液氮保存。

1.3 仪器与试剂 MK3-3酶标仪(美国热电)、荧光定量PCR仪(德国耶拿分)、lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α Elisa试剂盒购于上海邦奕生物科技有限公司。Trizol RNA提取试剂和逆转录(RT)试剂盒购自美国的Invitrogen Corporation(City，State，USA)，lncRNA MALAT1 RNA定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自上海GenePharma有限公司。使用的TePCR热循环仪是Roche LightCycler(Kaiseraugst，Rheinfelden，Switzerland)。

1.4 lncRNA MALAT1蛋白在病例组及对照组虹膜组织表达水平测定 通过使用1.3 lncRNA MALAT1兔多克隆抗体和抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二级抗体，在4 μm石蜡包埋的组织切片上进行1.3 lncRNA MALAT1蛋白表达的检测。使用3%过氧化氢溶液和蛋白质阻断试剂来终止蛋白质的酶活性和非特异性结合。组织切片的抗原修复在Tris EDTA缓冲液(pH值9.0)中进行。用二氨基联苯胺(DAB)底物和Mayer’s苏木精复染物检测阳性染色。以高放大倍数(40x)观察500个细胞。在至少5个视野中使用半定量方法对染色的组织切片进行评分。染色标准为0表示<5%阳性染色细胞(阴性表达)，+表示5%～20%阳性染色细胞(弱表达)，2+表示21%～50%阳性染色细胞(中度表达)和3+为> 50%阳性染色细胞(强表达)。

1.5 ELISA测定病例组及对照组虹膜组织 lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α蛋白水平 按照无菌条件操作，称取微量虹膜组织，加入少量液氮，在研钵中迅速将虹膜组织碾碎至粉末状；将组织粉末转入2 ml Eppendorf管中，加入1.2 ml PBS(pH值7.4)，充分振荡混匀，2 000 g，4℃，离心20 min。仔细收集上清液。获取虹膜组织组织匀浆后，采用Elisa法检测lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α蛋白水平。

1.6 病例组及对照组虹膜组织 lncRNA MALAT1mRNA水平的测定 qRT-PCR用于lncRNA MALAT1基因的相对mRNA表达。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Germany)从所有组织样品中分离总RNA。使用Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystem，USA)通过PCR扩增通过逆转录合成互补DNA(cDNA)。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystem，USA)和用于lncRNA MALAT1的特异性引物在Lightcycler 96系统(Roche，USA)上进行qRT-PCR：lncRNA MALAT1正向引物5’-CTATCGAAGGGACCTAG-3’，反向引物5’-ACCTACTTCAGCAGGCCTCG-3’(产品规格为150 bp)。β-肌动蛋白用作内部对照，引物序列是：正向5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’反向5’AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’(产物大小179 bp)。每份样品的qRT-PCR反应一式三份进行。TLR4、NF-кB的qRT-PCR热曲线为94℃：10 min、94℃：30 s、58℃：35 s、72℃：1 min；45个循环。通过相对基因定量方法(2-ΔΔCT方法)计算mRNA倍数变化。

2 结果

2.1 2组lncRNA MALAT1 蛋白表达评分比较 病例组lncRNA MALAT1蛋白表达评分高于对照组 (P<0.01)。见表2。

组别lncRNA MALAT1 对照组0.74±0.14病例组5.12±0.53t值29.369P值<0.001

2.2 2组中lncRNA MALAT1蛋白表达阴性率比较 病例组lncRNA MALAT1蛋白表达阳性率明显高于对照组(P<0.01)；免疫组化法下，lncRNA MALAT1阳性表达为棕褐色，lncRNA MALAT1阳性表达情况与其蛋白表达水平符合。见表3，图1。

2.3 2组lncRNA MALAT1 mRNA表达水平比较 病例组lncRNA MALAT1 mRNA表达水平高于对照组(P<0.01)。见表4。

表3 2组lncRNA MALAT1蛋白表达阴性率比较 n=92，例(%)

图1 lncRNA MALAT1在对照组、病例组的表达；A 在青光眼虹膜组织中表达；B 在糖尿病新生血管性青光眼虹膜组织表达

组别lncRNA MALAT1 mRNA对照组1.01±0.21病例组3.54±0.55t值20.364P值<0.001

2.4 2组组各炎症指标水平比较 病例组IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5。

项目对照组病例组t值P值IL-2(pg/ml)85.63±12.36263.65±48.6385.365<0.001IL-6(pg/ml)102.36±10.12329.32±36.9859.654<0.001hs-CRP(μmol/L)102.16±10.15367.12±26.1949.365<0.001TNF-α(mmol/L)25.49±1.92102.23±5.2358.219<0.001

2.5 lncRNA MALAT1蛋白表达评分、lncRNA MALAT1 mRNA与各变量的相关性分析 lncRNA MALAT1蛋白表达评分、lncRNA MALAT1 mRNA与IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α呈正相关差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 lncRNA MALAT1 蛋白表达评分、lncRNA MALAT1 mRNA与各变量的相关性分析

3 讨论

哺乳动物基因组包含数千个lncRNA基因，由于在许多生物过程和障碍中的潜在作用，它们已引起广泛关注[10]。最近，lncRNAs在血管生物学中的作用已逐渐被认识到。人冠状动脉平滑肌细胞的RNA测序鉴定了31个未注释的lncRNA，其中，lncRNA-SENCR被发现是富含血管细胞的lncRNA，其敲低导致心肌素和平滑肌收缩基因的表达降低[11]。lnc-Ang362是调节Ang Ⅱ的lncRNA，其水平的敲低影响了血管平滑肌细胞的增殖，提示其在Ang Ⅱ相关心血管疾病的诊断中的潜在作用[12]。lncRNA ANRIL，通过调节参与细胞增殖，细胞凋亡，细胞外基质重塑和炎症反应的基因表达，在动脉粥样硬化进展中发挥关键作用。而敲低lncRNA MALAT1表达水平，则提示体外增殖至迁移内皮细胞表型的平衡，其遗传缺失或药理学抑制可减少血管生长[13]。最新研究表明，lncRNA MALAT1可以激活p38/MAPK信号通路并调节糖尿病青光眼新生血管的生长。总之，lncRNA MALAT1作为基因表达调控因子的出现无疑会改变我们对病理性血管生成复杂调控网络的认识。

糖尿病新生血管性青光眼是长期糖尿病患者最常见的血管并发症之一。视力恶化、虹膜炎症、视网膜血管新生、血管通透性增加、血管细胞凋亡与其病情进展密切相关。高血糖是糖尿病最重要的特征，在糖尿病血管并发症发展过程中对血管细胞产生不良影响。MALAT1最初被鉴定为lncRNA，在非小细胞肺肿瘤转移的高风险个体中显示高表达，其表达在广泛的肿瘤中显着上调，如肺癌、肝癌、肾细胞癌、膀胱癌和骨肉瘤[14]。以前的研究表明，MALAT1在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移中具有积极作用[15]。研究发现，在体外细胞实验中，高血糖可导致视网膜内皮细胞和糖尿病虹膜细胞中lncMALAT1水平的显着上调，而沉默lncMALAT1的表达则可显著减轻糖尿病诱导的虹膜血管形成，血管渗漏和虹膜炎症。此外，研究同时发现，体外MALAT1的基因消除抑制了内皮细胞的增殖，迁移和管形成能力，这是内皮细胞生物学的典型方面[16]。本研究结果显示，病例组lncRNA MALAT1蛋白表达评分高于对照组；病例组lncRNA MALAT1蛋白表达阳性率明显高于对照组；病例组lncRNA MALAT1 mRNA表达水平高于对照组，这与上述讨论符合，提示lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜组织中表达水平升高；结合上述讨论，沉默lncRNA MALAT1表达有可能改善虹膜膜免于高血糖诱导的变性破坏，这将在后续研究中进一步探讨。

最新研究发现高葡萄糖应激能激MAPK信号传导途径， MAPK活化具有一系列生理作用[17，18]，如细胞炎性、细胞凋亡，细胞增殖，有丝分裂、多种基因转录；异常MAPK活性可导致持续的细胞增殖或对外部刺激的轻微反应。高水平的lncRNA MALAT1可显着改变磷酸化p38 MAPK的水平，进而磷酸化的ERK1/2或JNK1/2，激活MAPKs，导致其下游炎性因子过表达，本研究结果显示，病例组IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α水平高于对照组，差异有统计学意义；lncRNA MALAT1 蛋白表达评分、lncRNA MALAT1 mRNA与IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α正相关关系明显，差异有统计学意义。这与上述结论符合，同时也提示lncRNA MALAT1可诱导炎性反应加剧糖尿病新生血管性青光眼的病变程度。

综上所述，lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜组织中表达水平升高，其可诱导炎性反应加剧糖尿病新生血管性青光眼的病变程度。