艾菲提蒙汤对动脉粥样硬化家兔血管平滑肌迁移和增殖相关蛋白的影响

海尔尼沙古丽·依明 米热古丽·卡米力 窦勤 李治建 斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 探討艾菲提蒙汤对实验性动脉粥样硬化（AS）家兔血管平滑肌迁移和增殖的影响。 方法 48只家兔随机分为正常组，模型组，阳性对照组和艾菲提蒙汤高、中、低剂量组，每组8只。正常组给予普通饲料;其余5组饲喂高脂饲料，每日1次，连续60 d;造模同时给药，其中模型组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃辛伐他汀片0.002 g/kg，艾菲提蒙汤低、中、高剂量组分别灌胃3.3、6.5、13.0 g/kg药液，每日1次，连续60 d。免疫组化法测定艾菲提蒙汤对AS家兔增殖细胞核抗原（PCNA）和血小板衍生生长因子（PDGF）的影响，Western blot检测PCNA蛋白表达。结果 正常组可见极少量PCNA阳性细胞，细胞核内可见少量不均匀的棕黄色颗粒状物;模型组PCNA阳性细胞百分率高于正常组（P < 0.01）;与模型组比较，艾菲提蒙汤低、中、高剂量组PCNA阳性细胞百分率低于模型组（P < 0.05或P < 0.01）。正常组可见少量PDGF阳性细胞，细胞核内可见少量不均匀的棕黄色颗粒状物;模型组PDGF阳性细胞百分率高于正常组（P < 0.05），艾菲提蒙汤低、高剂量组PDGF阳性细胞百分率低于模型组（P < 0.05）。模型组PCNA蛋白含量高于正常组（P < 0.05）;阳性对照组、艾菲提蒙汤高剂量组PCNA蛋白含量显著低于模型组（P < 0.05）。 结论 艾菲提蒙汤对实验性AS家兔模型的形成有明显抑制作用，其机制与降低血管壁PCNA、PDGF的含量，降低家兔血管壁PCNA蛋白的表达作用有关。

[关键词] 艾菲提蒙汤;家兔;动脉粥样硬化;增殖细胞核抗原;血小板衍生生长因子

[中图分类号] R543.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（b）-0004-04

Effect of Aifeitimeng Tang on vascular smooth cell migration and proliferation-related proteins in rabbits with atherosclerosis

Haiernishaguli·Yiming1，2   Mireguli·Kmili3   DOU Qin2   LI Zhijian2   Silafu·Aibai1，2

1.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi   830054， China; 2.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine， Xinjiang Autonomous Region， Urumqi   830049， China; 3.Department of Laboratory， Uighur Medicine Hospital， Xinjiang Autonomous Region， Urumqi   830049， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Aifeitimeng Tang on vascular smooth cell migration and proliferation. Methods Forty-eight rabbits were randomly divided into normal group， model group， positive control group and Aifeitimeng Tang high， medium and low dose groups， with 8 rabbits in each group. Normal group was given normal feed. Other 5 groups were fed high-fat diet， once a day for 60 consecutive days. Model group was gavaged with normal saline， Simvastatin Tablets in positive control group were gavaged with 0.002 g/kg and Aifeitimeng Tang was gavaged with low， medium and high dose groups with 3.3， 6.5， 13.0 g/kg， once a day， for 60 consecutive days. Immunohistochemistry was used to determine the effect of Aifeitimeng Tang on proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and platelet derived growth factor （PDGF） in rabbits with AS， PCNA protein expression was detected by Western blot. Results In normal group， a small number of PCNA positive cells were observed， and a small amount of uneven brown-yellow granules were observed in the nucleus. The percentage of PCNA positive cells in model group was higher than that in normal group （P < 0.01）. The percentage of PCNA positive cells in Aifeitimeng Tang high， medium and low dose groups were lower than those in model group （P < 0.05 or P < 0.01）. A small number of PDGF positive cells were observed in normal group， and a small amount of uneven brown-yellow granules were observed in the nucleus. The percentage of PDGF positive cells in model group was higher than that in normal group （P < 0.05）， and the percentage of PDGF positive cells in Aifeitimeng Tang low and high dose groups were lower than those in model group （P < 0.05）. Conclusion Aifeitimeng Tang has a significant inhibitory effect on the formation of experimental rabbits model of AS， and its mechanism is related to the decrease of PCNA and PDGF content in the vascular wall and the decrease of PCNA protein expression in the vascular wall of rabbits.

[Key words] Aifeitimeng Tang; Rabbits; Athemsclerosis; Proliferating cell nuclear antigen; Platelet derived growth factor

艾菲提蒙汤是维医常用制剂，由合果藤、牛舌草、菊苣子、菟丝草等24味药材组成，主要用于治疗高血压、高脂血症等[1]。研究显示艾菲提蒙汤可显著降低动脉粥样硬化（AS）家兔血清总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平，改善AS家兔主动脉病理结构;明显降低家兔血清超敏C反应蛋白、血管细胞黏附分子浓度及血管核转录因子（NF）-κB的表达[2-5]。血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移、增殖是AS形成过程中的关键环节[6]。增殖细胞抗原（PCNA）和血小板衍生生长因子（PDGF）与VSMC的迁移、增殖密切相关[7]，是近年AS研究的新靶点。本研究采用高脂饲料喂养建立AS家兔模型，通过预防性给药，研究艾菲提蒙汤对AS家兔PDGF和PCNA的影响，Western blot分析PCNA蛋白的表达水平，深入探讨其对AS家兔模型血管平滑肌迁移和增殖影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物

艾菲提蒙汤（500 mL/瓶，批号：20150606）由新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂科制剂中心提供，辛伐他汀片（批号：20151208）购自杭州默沙东制药有限公司，PCNA免疫组化试剂盒（批号：20150624）、PDGF二抗（批号：20150514）购自美国Invitrogen公司，蛋黄粉（批号：20151203）购自安徽省亳州市红日蛋制品有限责任公司，胆固醇（批号：20140527）购自北京奥博星生物技術责任有限公司，自制猪油，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

大耳白家兔48只，雄性，体重1.8～2.2 kg，购自新疆实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2011-0001，动物合格证号：20160324。饲养环境及条件：温度18～28℃，相对湿度40%～70%。照明时间：人工光照12 h明暗周期，每日清扫动物房，每周定期采用84消毒液或过氧乙酸进行擦拭消毒，动物房操作人员每日记录检疫室和动物实验室的温度、湿度、地面消毒信息。本研究经新疆维吾尔医学研究院动物实验伦理委员会批准。

1.3 实验仪器

酶标仪（美国Bio-Rad公司）;低温高速离心机（美国Beckman CoulterTM公司）;GL-88B漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;Chemiscope 3000化学发光成像仪系统（上海勤翔科学仪器有限公司）;Mini-PROTEAN Tetra system蛋白转膜仪（美国Bio-Rad公司）;DYCZ-24DN电泳仪（北京六一生物科技有限公司）;TS-3D脱色摇床（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 家兔AS动物模型建立及药物干预 48只雄性家兔，单笼饲养，普通饲料饲养1周后，随机分为正常组，模型组，阳性对照组和艾菲提蒙汤高、中、低剂量组，每组8只。模型建立采用文献[8]方法，正常组给予普通饲料，模型组，阳性对照组和艾菲提蒙汤高、中、低剂量组给予高脂饲料（76%普通饲料+8%猪油+0.8%胆固醇+15%蛋黄粉）75 g/d，共60 d。造模开始后，模型组灌胃生理盐水、阳性对照组灌胃辛伐他汀片0.002 g/kg，艾菲提蒙汤低、中、高剂量组分别灌胃3.3、6.5、13.0 g/kg，每日1次，连续60 d。

实验结束取血后处死动物，迅速取出主动脉弓部约1 cm，放入冻存管中，液氮保存，用于Western blot检测。主动脉弓部以下约1 cm用10%中性甲醛溶液固定，模型组病理可见局部粥样灶形成，粥样灶形成周围见肉芽组织形成和淋巴细胞浸润，中膜平滑肌局部轻度增生，外膜未见明显异常，证实模型成功[4]，然后进行免疫组化法测定。

1.4.2 免疫组化法测定家兔PCNA和PDGF阳性细胞含量  包埋组织4 μm连续切片，常规脱蜡、水化;5%牛血清白蛋白封闭，加相应一抗40 μL，湿盒中4℃过夜;37℃恢复30 min，加二抗50 μL，湿盒中37℃孵育30 min;二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染5 min，自来水冲洗后盐酸酒精分化2 s，自来水冲洗10 min，碳酸锂溶液或磷酸盐缓冲液（PBS）返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，进行免疫组化法测定。按文献[5]方法对显微镜5个视野下阳性细胞记数，阳性细胞数百分率=1个视野下阳性细胞数/该视野下细胞总数，每只动物的阳性细胞数百分率为5个视野下的阳性细胞百分率的平均值。

1.4.3 Western blot检测家兔主动脉PCNA蛋白表达  取约100 mg主动脉组织加入200 μL RIPA裂解液，4℃放置60 min后，12 000 r/min离心15 min，离心半径8 cm，取上清，BCA法蛋白定量，电泳后，考马斯亮蓝染色90 min。洗脱液洗3次，10 min/次，漂洗过夜，加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，沸水加热处理5 min，12 000 r/min离心5min，取上清，Western blot检测PCNA蛋白表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐，组间两两比较采用LSD检验，方差不齐，组间两两比较采用Tamhane′s T2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 艾菲提蒙汤对AS家兔血管组织中PCNA、PDGF阳性细胞含量的影响

正常组可见极少量PCNA阳性细胞，细胞核内可见少量不均匀的棕黄色颗粒状物;模型组PCNA阳性细胞百分率高于正常组（P < 0.01）;艾菲提蒙汤低、中、高剂量组PCNA阳性细胞百分率低于模型组（P < 0.05或P < 0.01）。见表1、图1（封三）。

正常组可见少量PDGF阳性细胞，细胞核内可见少量不均匀的棕黄色颗粒状物;模型组PDGF阳性细胞百分率高于正常组（P < 0.05），艾菲提蒙汤低、高剂量组PDGF阳性细胞百分率低于模型组（P < 0.05）。见表1、图2（封三）。

表1   艾菲提蒙汤对动脉粥样硬化家兔主动脉PCNA、PDGF的影响（x±s，n = 8）

注：与正常组比较，#P < 0.05，##P < 0.01;与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。PCNA：增殖细胞核抗原;PDGF：血小板衍生生长因子

2.2 艾菲提蒙汤对AS家兔血管PCNA蛋白含量的影响

模型组PCNA蛋白含量高于正常组（P < 0.05）;阳性对照组、艾菲提蒙汤高剂量组PCNA蛋白含量显著低于模型组（P < 0.05）。见图3。

A：正常组;B：模型组;C：阳性对照组;D：艾菲提蒙汤低剂量组;E：艾菲提蒙汤中剂量组;F：艾菲提蒙汤高剂量组。与正常组比较，#P < 0.05;与模型组比较，*P < 0.05。PCNA：增殖细胞核抗原

图3   艾菲提蒙汤对AS家兔血管PCNA蛋白含量的影响（n = 8）

3 讨论

AS是一种慢性炎症性疾病[10]，是心血管疾病的病理基础，可导致急慢性心血管疾病[11-12]。早期AS与内皮损伤、脂质代謝异常和血流动力学损害相关[13-19]。并且AS的过程伴随着内皮细胞（ECs）流动介导的炎症改变。EC被激活后，细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）和其他炎性因子表达;大量低密度脂蛋白（LDL）被修饰为氧化LDL（oxLDL），并在血管内壁积聚，促进AS斑块的形成[20-21]。研究显示[2-5]，艾菲提蒙汤可明显降低家兔血清中超敏C反应蛋白、血管细胞间黏附因子的浓度，降低血管NF-κB的表达。PDGF亦是炎性反应中的重要因子，在缺氧或血管壁损伤等因素的刺激下，ECs、巨噬细胞中的PDGF释放增加，同时，PDGF是一种重要的促细胞分裂剂，可刺激多种细胞分裂和增殖，如成纤维细胞、平滑肌细胞等[22]。在AS的发展过程中，PDGF在VSMC迁移和增殖中起主要作用，尽管在健康和患病血管中均检测到PDGF的mRNA，但仅在患病血管中发现VSMC的迁移和增殖。PCNA是一种酸性蛋白质，存在于细胞核内，对细胞分裂及增殖起重要作用，其是DNA复制和修复过程中必不可少的辅助蛋白。血管壁PCNA的表达可反应血管细胞增殖活性的途径[23]。

综上所述，艾菲提蒙汤可通过抑制家兔PCNA和PDGF而预防AS发生。

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（收稿日期：2019-09-30  本文編辑：刘明玉）