脱落酸与水杨酸处理调节李果实抗冷性及氧化酶活性

张一冉 王雅楠 杨杨 韩育梅

摘要：为研究水杨酸（SA）提高李果实抗冷能力过程中脱落酸（ABA）的作用，本研究以黑琥珀李果实为原料，分别采用1.0 mmol/L SA、47.0 μmol/L ABA、5.0 mmol/L的Na2WoO4、1.0 mmol/L SA结合5.0 mmol/L的Na2WoO4以及蒸馏水为对照浸泡30 min。对李果实冷害指数、总酚含量、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性进行测定。结果表明，SA和ABA处理组降低了冷害指数，提高了其总酚含量并延缓了POD和PPO活性的上升，还显著地提高了SOD、CAT和APX等活性氧清除酶的活性，Na2WoO4、SA结合Na2WoO4处理组抗冷能力均低于对照组。说明SA和ABA可以延缓李果实的冷害，提高其抗冷性和活性氧代谢能力。Na2WoO4显著抑制李果实的抗冷性，且该作用不受SA的影响，表明SA提高李果实抗冷性依赖于ABA。

关键词：李果实;冷害;活性氧代谢;抗冷性

中图分类号：S662.3文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0471-06

Abstract：In order to study the role of abscisic acid （ABA） in the process of salicylic acid （SA） improving the cold resistance of plum fruit， Black Amber plum fruit was used as raw material and soaked in 1.0 mmol/L SA， 47.0 μmol/L ABA， 5.0 mmol/L Na2WoO4， 1.0 mmol/L SA combined with 5.0 mmol/L Na2WoO4， and distilled water （control group） for 30 min. Chilling injury index， total phenolic content， peroxidase （POD） activity， polyphenol oxidase （PPO） activity， superoxide dismutase （SOD） activity， catalase （CAT） activity， ascorbate peroxidase （APX） activity were measured. The results showed that the SA and ABA treatments reduced the chilling injury index， increased the total phenolic content， delayed the increase of POD and PPO activities and significantly increased the activities of active oxygen scavenging enzymes such as SOD， CAT and APX. The cold resistance of Na2WoO4 and SA combined with Na2WoO4 treatment groups was lower than that of the control group. It is indicated that SA and ABA can delay the chilling injury of plum fruit and improve its cold resistance and active oxygen metabolism. Na2WoO4 significantly inhibited the cold resistance of plum fruit， and the effect was not affected by SA， which indicated that SA depended on ABA to increase the cold resistance of plum fruit.

Key words：plum fruit;chilling injury;active oxygen metabolism;cold resistance

李果實在低温贮藏时极易发生冷害，造成果实腐烂变质，影响了产品贮藏品质和商品价值[1]。使用小分子信号物质调控果实冷害是近年来的研究热点。已有研究结果表明，可以通过施用一些外源物质（包括植物激素和植物生长调节剂在内的外源小分子物质）有效地调控活性氧代谢及抗氧化相关酶活性[2-4]，控制果实冷害的发生。

在逆境胁迫下，活性氧大量积累超出机体自由清除能力后，导致活性氧代谢失衡，最终植物受到损伤[5]。近年来的国内外研究结果表明，活性氧代谢失衡主要体现在清除活性氧自由基能力减弱、细胞膜脂过氧化程度加剧、抗氧化酶活性受到抑制等方面[6-7]。水杨酸（SA）可以提高保护酶的活性来清除活性氧，维持细胞膜系统的平衡，提高植物抵抗逆境胁迫的能力，从而达到保护植物细胞的作用。有研究结果表明，适宜浓度SA可以提高杏果实抗冷性及活性氧代谢[8]。类似的现象也在番茄[9]、桃[10]等果蔬中得到了验证。脱落酸（ABA）作为一种功能性激素，可以使植物对逆境做出快速应答[11]。在低温条件下，ABA可以通过调节植物体内水分及维持细胞膜稳定性多个方面来增加植物的低温胁迫、盐胁迫、水分胁迫的抵抗能力[12-13]。 ABA可以提高果实抗冷性，延长果实贮藏期已在草莓[14]、香蕉[15]、桃[16]等多种果蔬中得到证实。黄杏等在研究中指出钨酸钠可以抑制内源ABA合成并阻断其信号传递，还指出钨酸钠可以抑制甘蔗幼苗的抗冷性和抗氧化能力[17]。但是SA和ABA对果实的抗冷信号是否存在交叉，二者之间相互关系怎样，以及ABA是否参与了SA提高植物抗冷性的信号过程还有待研究。

因此，本研究采用SA、ABA、ABA合成抑制剂钨酸钠（Na2WoO4）以及SA结合Na2WoO4，蒸馏水为对照分别浸泡处理李果实，通过研究其对冷害及活性氧相关酶活性的影响以明确SA、ABA处理减轻李果实冷害的作用，并通过Na2WoO4阻断ABA的合成，探究SA提高李果实抗冷性是否依赖于ABA。

1材料与方法

1.1试验材料

李果实为中等熟度（果实颜色紫红色，着色面积占2/3，香气明显，手感较软）的黑琥珀李果实，从内蒙古呼和浩特市土左旗李子种植基地采摘获得，大小、成熟度均一，无病虫害。

1.2仪器与设备

TGL-16M高速冷冻离心机由上海卢湘离心机仪器有限公司生产，T6新世纪型紫外分光光度计由北京普析通用仪器有限公司生产，DDSJ-318电导率仪由上海仪电科学仪器股份有限公司生產，电热恒温水浴锅由北京长安科学仪器厂生产。

1.3试验方法

1.3.1样品处理将李果实随机分成5组，分别采用1 mmol/L SA、47 μmol/L ABA 、5 mmol/L钨酸钠、1 mmol/L SA结合5 mmol/L钨酸钠、蒸馏水（对照组）浸泡30 min后，取出晾干。置于4 ℃下存放，每隔6 d取样30个果，将果肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块用液氮速冻后放置于-80 ℃下，用于记录冷害发生情况及活性氧相关代谢指标的测定。每个处理组150个果实，重复3次。

1.3.2测定指标和方法

1.3.2.1冷害指数的计算参照郭雨萱等[18]的方法。根据受冷害程度共分为5级。1级，没有冷害;2级，轻微冷害：表面有直径小于0.5 cm的凹陷或褐色斑点;3级，中度冷害：表面有直径超过1 cm的褐色斑;4级，严重冷害：褐变面积已超过果实的1/3;5级，极其严重：果实已发生完全褐变。

冷害指数=（冷害级别数×发生冷害的果实个数）

1.3.2.2总酚含量的测定根据曹建康等[19]的方法，略有改动。提取缓冲液为1% HCl-甲醇溶液。以提取缓冲液为空白，测定提取液在280 nm下的吸光值，以每克李果实组织在波长280 nm处的吸光值为总酚含量。

1.3.2.3过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的测定根据曹建康等[19]的方法，略有改动。POD活性测定：提取缓冲液为0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠，pH 6.6，其中含4% （质量体积比） PVPP和1% Triton X-100。0.5 ml提取液，加3.0 ml 25 mmol/L 愈创木酚溶液和0.2 ml 0.5 mol/L H2O2溶液启动反应。在反应15 s时开始记录反应体系在470 nm处吸光值，5 min内每隔30 s记录1次。PPO活性测定：提取缓冲液为0.1 mol/L乙酸-乙酸钠，pH 5.5，其中含1 mmol/L聚乙二醇6000，4% （质量体积比） PVPP，1% Triton X-100。100 μl提取液，加4.0 ml 50 mmol/L（pH 5.5）的乙酸-乙酸钠缓冲液和1.0 ml 50 mmol/L的邻苯二酚溶液，在反应15 s时开始记录反应体系在420 nm处吸光值，6 min内每隔1 min记录1次。

1.3.2.4活性氧代谢相关酶（SOD、CAT、APX）活性的测定根据曹建康等[19]的方法，略有改动。SOD活性测定：采用氮蓝四唑比色法。提取缓冲液为0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.8，其中含5 mmol/L DTT二硫苏糖醇和5% PVP。0.1 ml提取液，加入1.7 ml 50 mmol/L（pH 7.8）磷酸缓冲液，0.3 ml 13 mmol/L甲硫氨酸（MET），0.3 ml 75 μmol/L氮蓝四唑（NBT），0.3 ml 10 μmmol/L EDTA-Na2和2 μmol/L核黄素，光照25 min后，记录在560 nm下的吸光值。CAT活性测定：提取缓冲液为0.2 mol/L（pH 7.9）磷酸钠缓冲液，其中含133 L Triton-X100。吸取20 μl提取液，加1.5 ml（pH 7.9）磷酸钠缓冲液，再加1 ml蒸馏水，30 ℃静置30 min。测定时再加入0.3 ml 0.1 mol/L H2O2，在反应15 s时开始记录反应体系在240 nm处吸光值，5 min内每隔30 s记录1次。APX活性测定：提取缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），其中含0.1 mmol/L EDTA，1.0 mmol/L抗坏血酸和2% PVPP。0.1 ml提取液，加入2.6 ml反应缓冲液和0.3 ml 2 mol/L的H2O2溶液，5 min内每隔30 s记录1次在290 nm下的吸光值。

1.4数据处理

应用Excel 2007统计分析所有数据，计算标准偏差并制图。应用SPSS16.0软件对所有数据进行方差分析和差异显著性分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2结果与分析

2.1不同处理对李果实冷害指数的影响

由图1可以看出，随着贮藏时间延长，各处理组果实冷害程度不断增加。其中ABA处理组冷害指数上升速度低于对照组（P<0.05），Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组上升速度高于对照组（P<0.05）。18 d以后，SA和ABA处理组冷害指数显著低于对照组（P<0.05），而Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组显著高于对照组（P<0.05），且均在30 d达到最大值。表明，SA和ABA能够显著抑制果实采后冷害的发生，ABA合成抑制剂Na2WoO4降低了果实的抗冷能力，且该作用不受SA的影响。

2.2不同处理对李果实总酚含量的影响

酚类物质主要与果实的色泽发育、成熟衰老、组织褐变、抗逆性和抗病性有关。如图2所示，随着贮藏时间延长，对照组总酚含量呈现先升高后下降的趋势。SA和ABA处理组的上升速度显著高于对照组（P<0.05），Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组的上升速度显著低于对照组（P<0.05）。SA和ABA处理组的总酚含量分别在第24 d和30 d达到最大值，且显著高于对照组（P<0.05）。Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组的总酚含量始终显著低于对照组（P<0.05）。表明，SA和ABA提高酚类物质含量可能与提高果实抗病能力有关，ABA合成抑制剂Na2WoO4显著抑制了ABA这一能力，且该作用不受SA的影响。

2.3不同处理对李果实POD和PPO活性的影响

PPO和POD可促使果实内酚类物质氧化发生褐变，褐变是果实发生冷害的首要现象，导致果实品质下降[20]。如图3所示，随着贮藏时间延长，对照组的POD活性呈现上升趋势，并在30 d达到最大值。在贮藏期间的第12 d、第24 d、第30 d，SA和ABA处理组的上升趋势显著低于对照组（P<0.05），且ABA处理组在整个贮藏期间始终维持较低水平。而Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组上升趋势显著高于对照组（P<0.05）。第12 d、第30 d时，SA处理组的POD活性显著低于对照组（P<0.05），而Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组的POD活性在第30 d时迅速上升达到最大值，显著高于对照组（P<0.05）。如图4所示，贮藏期间PPO上升趋势与POD上升趋势一致。表明，SA和ABA可以延缓果实POD和PPO活性的上升，抑制果实氧化褐变，延缓果实冷害。ABA合成抑制剂Na2WoO4加剧果实氧化褐變，该作用不受SA的影响。

2.4不同处理对李果实SOD、CAT和APX活性的影响

SOD、CAT和APX作为活性氧清除酶，可以有效地减少活性氧积累，减轻细胞膜伤害[21]。如图5所示，对照组SOD活性呈现先升高后下降的趋势，在第6 d达到最大值。SA和ABA处理组的上升速度显著高于对照组（P<0.05），且在第18 d达到最大值后缓慢下降。第6 d后，Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组整体呈现下降趋势。SA结合Na2WoO4处理组虽在第18 d SOD活性升高，但在第24 d后活性迅速下降，显著低于对照组（P<0.05）。SA和ABA处理组的SOD活性在第18 d后显著高于对照组（P<0.05），Na2WoO4处理组在第12 d后SOD活性与对照组无显著性差别，SA结合Na2WoO4处理组在第6～12 d与对照无显著性差别，在第24～30 d显著低于对照组（P<0.05）。如图6所示，CAT活性变化趋势与SOD活性变化趋势一致，但Na2WoO4处理组的上升速度略高于对照组。如图7所示，APX活性变化趋势与SOD活性变化趋势一致。在第24 d后，SA和ABA处理组的APX活性显著高于对照组（P<0.05），Na2WoO4和SA结合Na2WoO4处理组的APX活性显著低于对照组（P<0.05）。表明，SA和ABA能够显著提高果实对活性氧的清除能力，而ABA合成抑制剂Na2WoO4显著抑制了活性氧清除酶的活性，且该作用不受SA的影响。

3讨论

果蔬在正常条件下，其活性氧产生能力与消除能力相抵消，系统稳定。但在不适低温条件下，就会造成活性氧代谢紊乱，膜脂过氧化造成细胞膜的损伤，最终导致冷害的发生。从生理的角度看，低温影响抗氧化酶的活性，所以一般以抗氧化酶作为研究果蔬冷害的对象[22]，抗氧化酶主要有SOD、POD、CAT等[23-24]。SA可以减轻膜脂过氧化，提高抗氧化酶活性，加强活性氧代谢途径来减轻低温伤害。ABA可以提高果蔬抵御逆境胁迫的能力。ABA处理甘蔗的研究发现施用外源脱落酸可以诱发内源脱落酸的增加，有效提高其抗冷能力[25]。徐文玲等[26]发现外源ABA可以有效提高大白菜相关抗氧化酶的活性。孔祥佳[27]通过热处理对橄榄叶抗冷性的研究指出，降低果实内POD和PPO活性可以有效地延缓果实内酚类物质的下降，并且通过保持其细胞结构的完整，抑制果实POD、PPO与果实酚类物质接触，从而延缓果实褐变，减轻冷害的发生。酚类物质不但可以提高生物对逆境胁迫的抵御能力，而且具有很强的抗氧化能力[28]。李文娟等[29]在施用外源氯化钾对玉米的研究中指出，通过对酚类物质代谢的调节，还可以提高其抗病性。本研究希望通过SA、ABA等外源小分子物质处理李果实，通过提高其总酚含量及氧化酶活性，进而提高植物的抗冷性。

本研究结果表明，经过SA、ABA处理后的李果实可以降低冷害指数，说明SA和ABA可以延缓冷害的发生，降低冷害的损伤速度。SA、ABA处理提高了李果实的总酚含量并推迟了POD、PPO活性的升高，不但提高了果实的抗病性，还延缓其褐变和冷害的发生。而活性氧代谢相关酶SOD、CAT、APX活性显著提高，抑制了膜脂过氧化的发生，维持活性氧代谢平衡。这与前人在杏果实[30]、蓝莓果实[31]、猕猴桃果实[32]的研究结果一致。

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（责任编辑：陈海霞）