偏治颗粒对硝酸甘油诱导偏头痛大鼠模型的防治作用及机制研究※

姜 瑾 任 平 王 莹 刘 悦 许 杰 李国信

(辽宁中医药大学附属第二医院学科学位办公室，辽宁 沈阳 110034)

偏头痛又称血管神经性头痛，是一种以头痛暴作、疼痛剧烈、或左或右、反复发作为特征的常见病、多发病[1]。某些易感个体服用硝苯地平片、硝酸异山梨酯片或硝酸甘油片后可出现典型的偏头痛发作[2]。现代医学治疗以终止头痛发作、缓解伴发症状和预防复发为原则。但西药治疗副作用大，易形成药物依赖，甚至发展为药物依赖性头痛或慢性偏头痛，目前尚缺乏理想的治疗手段[3]。中医药治疗偏头痛积累了数千年的经验，中医药典籍中记载的有效方药较多[4]。偏治颗粒是由《医学集成》中偏治汤加减而成，主要药物为白芍、白术、当归、茯苓、柴胡、半夏、芥子，主治偏头痛、吐沫流涎等。本实验通过观察偏治颗粒对硝酸甘油诱导偏头痛大鼠模型的影响，以期探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠60只，8周龄，体质量180～220 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。饲养于辽宁省中医药研究院动物实验室，实验动物屏障系统内温度为22～25 ℃，湿度为55%～60%，大鼠自由饮水，昼夜循环光照。

1.1.2 实验药物及试剂 偏治颗粒(药物组成：白芍6 g，焦白术6 g，当归2 g，茯苓2 g，柴胡2 g，半夏6 g，芥子3 g，甘草3 g)，由辽宁中医药大学附属第二医院提供(批号：20161123)，5 g/袋，每袋相当于生药30 g。琥珀酸舒马普坦片(天津华津制药有限公司，国药准字H20040700)，100 mg/片。无水乙醇(沈阳市新化试剂厂)；磷酸盐缓冲液(PBS，北京索莱宝科技有限公司)；大鼠降钙素基因相关肽1型(CGRP-1)免疫组化试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；大鼠P物质免疫组化试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；DAB显色试剂盒、柠檬酸盐缓冲液(福州迈新生物技术开发有限公司)；10%水合氯醛溶液(北京市旭东化工厂)；二甲苯(沈阳市新化试剂厂)；TMS-P超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，包含生物素标记的二抗(兔抗鼠)、内源性过氧化物酶阻断剂和链霉亲和素-过氧化物酶；苏木素染液(珠海贝索生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器 光学显微镜[BX53型，奥林巴斯(中国)有限公司]；电热恒温培养箱(JKDP-2型，厦门医疗电子仪器厂)；烤片机(YG-280KX型，湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司)；全自动脱水机(TP1020型，德国徕卡公司)；冰冻切片机(CM1950型，德国徕卡公司)；摊片机(YG-280KX型，湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组[5]将60只SD大鼠按照随机数字表法分为6组，即空白组、模型组、偏治颗粒低剂量组(5.4 g生药/kg)、偏治颗粒中剂量组(10.8 g生药/kg)、偏治颗粒高剂量组(20.16 g生药/kg)及对照组(琥珀酸舒马普坦片18 mg/kg)，每组10只。

1.2.2 造模 偏治颗粒低、中、高剂量组及对照组分别予相应的药物预防给药7 d，每日1次灌胃，给药容积为10 mL/kg，空白组、模型组均予等容积蒸馏水。末次灌胃1 h后，除空白组外，其余5组大鼠均皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，制备偏头痛大鼠模型[6-7]，各组大鼠出现耳红为造模成功。

1.3 取材方法 各组大鼠按照3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液，麻醉后将大鼠仰卧位固定于操作台，开胸暴露心脏，将灌注针刺入左心室，右心耳剪孔，使用0.9%氯化钠注射液200 mL冲洗至肝脏变白，然后用4%多聚甲醛固定液(0.01 mol/L PBS配制，pH 7.4)200 mL为灌流固定，直至身体僵硬震颤为止[8-9]。断头、开颅取全脑，分离出三叉神经脊束核，置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h。固定后的三叉神经脊束核用酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片备用。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 各组大鼠耳红出现及消失时间 对造模后各组大鼠耳红出现及消失时间进行观察。

1.4.2 大鼠三叉神经脊束核神经元免疫组化CGRP-1和P物质表达的积分光密度值(IOD)检测 免疫组化染色方法为SP法：石蜡切片，60 ℃恒温加热3 h，常规脱蜡至水。内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min。蒸馏水冲洗1次，于PBS中浸泡5 min。放入pH 7.0的柠檬酸盐缓冲液中高压修复5 min[10]。室温自然冷却，血清封闭15 min后去除血清封闭液。滴加经PBS稀释的一抗(CGRP-1 1∶150，P物质1∶200)，37 ℃孵育2 h。使用PBS冲洗5次，每次3 min。滴加生物素标记的二抗(兔抗鼠)，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗5次，每次3 min。然后滴加链霉亲和素-过氧化物酶,37 ℃孵育30 min。PBS冲洗5次，每次3 min。滴加DAB显色剂，自来水充分冲洗后，苏木素染液复染，中性树胶封片[11]。使用光学显微镜于200倍镜下观察免疫组化染色切片，采用ImageJ软件对免疫组化图片进行灰度值分析，计算各组大鼠IOD。IOD=log[gv0/gv)]，gv0为背景灰度值，gv为目标区灰度值[12]。抗体表达越强，IOD越大，对应的图片染色越深。

2 结 果

2.1 各组大鼠耳红出现及消失时间比较 见表1。

组 别n耳红出现时间耳红消失时间空白组10--模型组103.24±0.57157.23±14.28偏治颗粒低剂量组103.57±0.72150.52±14.33偏治颗粒中剂量组104.26±0.75∗141.37±13.23∗偏治颗粒高剂量组104.61±0.81∗132.48±13.38∗对照组104.73±0.85∗127.41±12.26∗

与模型组比较，*P<0.05

由表1可见，偏治颗粒中、高剂量组及对照组大鼠耳红出现时间较模型组增加(P<0.05)，耳红消失时间较模型组缩短(P<0.05)。偏治颗粒中、高剂量组与对照组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠三叉神经脊束核神经元CGRP-1和P物质表达的IOD比较 见表2。

组 别nCGRP-1P物质空白组100.024±0.0150.065±0.011模型组100.463±0.138∗0.237±0.062∗偏治颗粒低剂量组100.418±0.1520.201±0.058偏治颗粒中剂量组100.332±0.103△0.179±0.052偏治颗粒高剂量组100.235±0.096△0.124±0.044△对照组100.187±0.087△0.137±0.041△

与空白组比较,*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

由表2可见，模型组大鼠CGRP-1和P物质表达的IOD均高于空白组(P<0.05)。偏治颗粒中、高剂量组及对照组CGRP-1表达的IOD均低于模型组(P<0.05)，偏治颗粒中、高剂量组与对照组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。偏治颗粒高剂量组及对照组P物质表达的IOD均低于模型组(P<0.05)，偏治颗粒高剂量组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色后各组大鼠三叉神经脊束核神经元CGRP-1和P物质表达见封2，图1、2。

3 讨 论

偏头痛为发作性的颅内和颅外血管功能障碍，以反复发作的头痛为特征[13]。偏头痛的病因尚不明确，女性偏头痛倾向于月经来潮前发作，提示发病可能与内分泌或水钠潴留有关。精神紧张、强光刺激、低血糖、应用扩血管药物或食用高酪胺食物、酒精类饮料，均可诱发偏头痛发作。各种诱因引发偏头痛大体可分为血管源学说和神经源学说。典型偏头痛先有颅内动脉收缩，局部脑血流减少，引起视觉改变、感觉异常或轻偏瘫等先兆症状，继而颅内、颅外动脉扩张，出现头痛。中医学认为，偏头痛主要是在感受风邪、情志内伤、饮食不节、忧思劳累、久病致瘀的基础上，造成肝、脾、肾等脏腑功能失调，风袭脑络，风阳内动，痰火阻滞所致。治宜平肝熄风，化痰清热。偏治颗粒中白芍为君药，养血敛阴，柔肝止痛；白术、当归、茯苓为臣药，燥湿健脾，补血益气；柴胡、半夏、芥子为佐药，疏肝升阳，燥湿化痰；甘草为使药，缓急止痛，调和诸药。中药治疗偏头痛的机制主要在于抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集，降低脑内血清素含量，达到解痉、止痛作用[13]。本研究中偏治颗粒中、高剂量组大鼠耳红出现时间增加(P<0.05)，说明偏治颗粒具有延缓硝酸甘油诱发偏头痛大鼠头部血管扩张的作用。偏治颗粒中、高剂量组耳红消失时间缩短(P<0.05)，说明偏治颗粒可缩短硝酸甘油诱发偏头痛大鼠头部血管扩张时间。

CGRP是已知最强的扩血管物质，具有降低外周阻力、舒张肾动脉、增加肾血流量的作用[14]。CGRP可舒张冠状动脉，用于治疗冠状动脉粥样硬化，其舒张血管的作用不依赖于血管内皮的存在，说明CGRP可有选择地结合降钙素受体。CGRP对所有血管均有明显舒张作用，其作用较乙酰胆碱等物质强。CGRP是广泛分布于神经系统的一种神经肽，其在外周及脊髓参与伤害性信息的传递及痛敏化的形成，并与P物质、辣椒素1型受体、阿片受体、神经生长因子、5-羟色胺、糖皮质激素等生物活性物质在痛觉调制过程中相互影响[15]。偏头痛患者可检测到由三叉神经所释放的CGRP，三叉神经分布于涉痛区域，偏头痛可能就是一种神经源性炎症。还有一种解释是小脑动脉和大脑后动脉肿胀造成的第Ⅲ对脑神经的损害，也可能为神经的炎症[5]。本研究中偏治颗粒中、高剂量可降低大鼠三叉神经脊束核神经元CGRP-1的表达，因而产生减轻神经血管性炎症性头痛的作用。

P物质是分布于神经纤维内的一种神经肽，也被称为速激肽。当神经元受刺激后，P物质可在中枢和外周神经末梢释放，与速激肽1受体(NK1)结合发挥生理作用[16]。在中枢末梢释放的P物质与痛觉传递相关，能直接通过促进谷氨酸的释放参与痛觉传递。逆向电刺激感觉神经或经细传入纤维传出的轴突反射可使外周端末梢释放P物质，引起该神经支配区血管扩张、通透性增加等神经源性炎性反应[17]。因此，P物质的主要功能是传递痛觉信息，外周伤害性感觉经传入纤维传至脑干，释放P物质，激活二级伤害感受神经元，向脑内痛觉中枢传递痛觉信息。偏治颗粒高剂量组可降低大鼠三叉神经脊束核神经元P物质表达，起到阻断P物质引起神经源性炎性反应的作用。

综上所述，偏治颗粒可通过调节CGRP-1和P物质在三叉神经脊束核神经元中的表达对偏头痛大鼠模型产生保护作用，为偏治颗粒临床治疗偏头痛提供了实验依据。